油菜抗ALS除草剂突变体的蛋白质组学初步分析开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

油菜是我国主要油料作物之一，在油菜生长过程中田间杂草问题一直危害着油菜的生长，导致油菜的产量和品质下降。化学除草能有效控制田间杂草，而抗除草剂油菜较之传统油菜，能大幅度降低生产成本，增加种植者的效益。因此选育抗除草剂油菜是实现化学除草的有效途径。

als抑制剂类除草剂通过抑制植物体内的als酶活性阻止植物合成支链氨基酸，从而导致植物生长受抑制而死亡[1]。如今，als抑制剂类除草剂已成为全球应用最广泛的除草剂之一，具备生物活性高、杀草谱广、选择性强、土壤残留活性低、对哺乳动物毒性低和对环境安全等优点。许多国内外研究都表明，植物对als抑制剂类除草剂的抗性机制主要分为靶标抗性和非靶标抗性。靶标抗性主要通过靶标酶基因位点突变和靶标酶过量表达两种方式产生抗性，其涉及的基因单一、遗传方式简单、抗性程度高，故便于抗性育种的利用[2]。非靶标抗性则主要指植物抗性生物型对除草剂代谢解毒能力的提高从而产生抗性[3]。油菜抗als抑制剂类除草剂突变体主要通过4种途径获得[4]：自然突变、种子化学诱变、组织培养与花粉诱变、小孢子诱变与转基因。国外研究人员通过以上4种途径在20世纪90年代就获得了水稻、小麦、玉米、大豆、油菜等作物的抗性突变体，并对抗除草剂作物进行了商业化生产。由于创制抗除草剂新品种的费用仅相当于开发一个新除草剂费用的1%-5%，所以近30年来，培育抗除草剂作物新品种的工作发展迅速[5]。1989年swanson[6]等首次报道了以小孢子诱变途径获得油菜抗als抑制剂类除草剂的抗性品种。20世纪90年代初美国氰胺公司研制出抗咪唑啉酮类除草剂玉米，进而创制出一系列抗性作物并推广，包括小麦、水稻、油菜等[7]。迄今为止，国外商业化生产的抗als抑制剂类除草剂的油菜主要是巴斯夫公司的抗imi类除草剂的油菜[8]，而国内缺少自主开发的抗als抑制剂类除草剂的油菜品种。

2004年江苏省农业科学院的高健芹等[9]在喷施imi类除草剂的油菜和大豆多年轮作的试验田中发现了抗性油菜自然突变株m9。这是国内首次报道的抗als类除草剂油菜新种质，对我国开展创制抗als类除草剂油菜新种质的工作有着重要的意义。本课题通过蛋白质组学方法研究m9应答除草剂处理的代谢通路，挖掘抗性相关重要蛋白，对于阐明其抗性机理，培育抗als类除草剂作物具有重要意义。

2. 研究的基本内容和问题

（1）研究目标：

通过对油菜抗als抑制剂类除草剂突变体的比较蛋白质组学研究，为阐释油菜抗性突变体m9抗als抑制剂类除草剂的抗性机制和抗除草剂作物的选育奠定基础。

（2）研究内容：

3. 研究的方法与方案

（1）研究方法、技术路线和实验方案：

1.差异蛋白鉴定

对itraq鉴定到的蛋白按不同时间点进行差异表达分析，当mvp:wtp的p-value0.05，ratio（ratio=mvp:mvm/wtp:wtm）1.5或0.666667时视为差异表达蛋白。再根据差异蛋白在3个时间点的上下调情况分类，mvp:wtp1.5且mvp:mvmwtp:wtm视为上调蛋白，mvp:wtp0.666667且mvp:mvmwtp:wtm则视为下调蛋白（mv、wt分别为突变体油菜和野生型油菜的蛋白质鉴定结果数据，p表示喷施除草剂组的数据，m表示未喷施除草剂的数据）。之后根据3个时间点蛋白上下调趋势一致与否，制作不同类型变化趋势的维恩图和折线图。

4. 研究创新点

本研究所使用的实验材料中突变体油菜品种是自然突变得来的，而非转基因材料，故更容易为人们所接受。但该突变体的抗性机制还不清楚，且至今尚未发现有抗ALS抑制剂类除草剂的蛋白质组学相关研究的公开报道。

5. 研究计划与进展

2018年7月上旬2018年9月上旬，搜集并整理相关文献资料，进行实验设计和实验方法讨论，做好实验前期准备工作；

2018年9月下旬-2018年10月上旬，突变体与野生型在不同时间点的蛋白相关数据的整理，找出不同时间点的差异蛋白，将差异蛋白按不同变化趋势进行分类，并制作维恩图和变化折线图；

2018年10月下旬-2019年3月，相关数据的分析整理，荧光定量pcr验证实验；