胡萝卜软腐果胶杆菌相关基因敲除与功能验证开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

意义：胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种（pectobacterterium carotovorum subsp. carotovorum），属于变形菌门，γ-变形菌纲，肠杆菌科，果胶杆属，革兰氏阴性兼性厌氧细菌（方中达，1998）。它是引起细菌性软腐病的重要病原菌，经伤口或自然孔口侵入寄主，使之产生病斑，出现腐烂并伴随恶臭，其寄主广泛，能使多种经济作物及观赏性植物发病，如大白菜、胡萝卜、黄花马蹄莲等，并造成严重的经济损失。

在病原菌与寄主发生相互作用的过程中，病原物所产生的致病因子是决定病原菌成功入侵并最终导致寄主产生病害症状的重要因素。而致病因子需要有效地定位在胞外的作用部位才能发挥其致病作用，这就需要分泌系统为这些致病因子提供通道来完成定位过程（邓亚岷，2013）。细菌六型分泌系统（type Ⅵ secretion system 简称t6ss）是直到2006年才被发现和命名的，相关研究并不完善。在胡萝卜软腐果胶杆菌中存在完整的六型分泌系统基因簇，本实验室前期研究发现，将胡萝卜软腐果胶杆菌pccs1菌株中的potg基因敲除后，病原菌致病能力下降，转录组分析后多个基因发生表达差异，potg在与黄花马蹄莲互作中上调表达，六型分泌系统中的四个基因clpv、impc、impb及vc_a0118发生下调表达，由此推测t6ss与病原菌的致病性有着非常密切的关系。随着p. carotovorum subsp. carotovorum pc1、p.carotovorum subsp. carotovorum pcc21和pseudomonas aeruginosa等病原细菌基因组陆续被公布，使得高通量鉴定目的基因变得可行（stefan pukatzki et al.2009）。

本课题为pccs1六型分泌系统相关基因dotu基因的敲除及功能分析，它在pc1中基因编号3247（ncbi），通过同源比对，在pccs1中找到了该基因，其连同icmf基因与t6ss的元件装配和功能的稳定性有关。本研究意在探索t6ss在胡萝卜软腐果胶杆菌致病过程中如何发挥作用，进一步揭示该病原菌的致病分子机制。

2. 研究的基本内容和问题

研究目标：运用同源重组原理进行基因敲除，以突变体和野生型相比较来判断dotu基因是否与六型分泌系统致病性相关。

研究内容：通过生物信息的查找和同源比对，在pccs1中找到了与六型分泌系统相关的基因。挑取其中的dotu基因进行双交换敲除，得到缺失突变体后首先测定致病性，再进行蛋白酶、纤维素酶、果胶酶等表型测定。

拟解决的关键问题：

3. 研究的方法与方案

研究方法：采用细菌学、分子生物学、生物信息学等。

技术路线：(1)选取目的基因两端或旁侧的序列设计引物，进行pcr扩增；(2)构建缺失相应基因的融合片段；(3)将融合片段克隆于pex18gm载体多克隆位点上，获得重组质粒,重组质粒通过热击转化的方式导入到top10感受态细胞中，作用是获得大量的重组质粒，再提取；(4)重组质粒通过热击转化的方式导入到bw感受态细胞中，融合片段与目的基因之间发生同源交换；(5)具有卡那霉素抗性的转化子是由于载体上一端的同源臂片段与目标基因发生第一次同源交换，载体dna整合进入宿主菌染色体中的结果；(6)发生单交换的转化子再接种于不含抗生素的lb培养液中生长，后涂布于含10%蔗糖的lb培养基上进行生长，由于载体上sacb基因在含有蔗糖的培养基上具有自杀的能力，促进同源臂片段与目的基因之间发生第二次同源重组，生长3-4天，挑取单菌落分别于rif100和rif100 gm50平板上生长，不能在rif100 gm50平板上生长的菌落为发生第二次同源重组时载体从染色体上脱离后产生的双交换子；(7)如果第二次同源重组发生在第一次己交换的同源臂和目的基因之间，载体脱离染色体，基因恢复为野生型(即没有得到缺失突变体)，如果第二次同源重组发生在另一端同源臂与目的基因之间，就能够得到缺失目的基因的突变体。

实验方案：

4. 研究创新点

特色或创新之处：

（1）双向电泳得到差异表达蛋白，找到待研究基因的相关信息。

（2）利用双交换敲除细菌基因，获得六型分泌系统基因缺失突变体。

5. 研究计划与进展

研究计划：

2013.8.1-8.3 学会使用bioxm和primer premier 5软件来设计pcr引物；

2013.8.4-8.6 查阅有关文献；