二化螟CO1基因的种内分化开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

hebert等(2003)认为线粒体细胞色素氧化酶亚基Ⅰ（coⅠ）基因作为动物物种鉴定的条形码序列具有很多优势: (1)大多数细胞中都有上百个以上的线粒体，每个线粒体都有一组染色体，因此等量的样品中线粒体dna比细胞核dna更容易被放大和使用；(2)线粒体dna的突变速度是核dna的10倍，利用线粒体dna更容易识别物种的变异；(3)线粒体属母性遗传，很少发生基因重组； (4) 动物生命中绝大部分阶段都存在明显的coi基因序列，coi基因和其他蛋白编码基因一样，其密码子第3位碱基不受自然选择压力的影响，可以自由变异； coi不仅具有足够的变异信息，同时又有较好的序列保守性，很容易被通用引物扩增；很少存在序列插入和缺失现象，使序列比对容易操作；拥有较多的系统发育信号。因此，hebert等(2003)他们通过对动物界11个门13320个物种coⅠ基因序列的比较分析发现，除腔肠动物cnidaria外，98%的物种遗传距离的差异在种内为0% ~2%，种间平均可达到11. 3%（hebert, 2003; 2004）。目前，基于coⅠ的dna条形码概念已经被全球科学界广泛接受，相关研究也已经在动物界广泛开展。已有报道资料显示，利用线粒体条形码技术对不同昆虫的种，甚至种下类群均可以进行有效的鉴定(潘程莹，2006)。

目前国际上明确提出的 dna 条形码计划有 6个，分别针对鳞翅目、毛翅目，及双翅目和膜翅目的2 个科展开（杨倩倩等，2012）。近年来，除上述已开展的昆虫条形码计划中涉及的类别外，弹尾目 ( hogg and hebert，2004 )、等翅目 ( fosteret，2004)、蜉蝣目 ( ball，2005)、鞘翅目( monaghan，2005 )、直翅目 ( 潘程莹等，2006)、蜻蜓目 ( rach，2008)等均已开展了dna条形码研究。就国内外文献报道分析，研究昆虫mtdna coi条形码，主要集中在辅助发现和描述新种和隐种、种类分子鉴定、系统发育研究，以及入侵物种的鉴定和法医昆虫学方面。

本课题为了建立稻田蛀秆螟虫的简易分子鉴定方法，本研究首先以分布最广泛的水稻螟虫二化螟为代表虫种，克隆并比较螟虫不同地理种群及个体之间的线粒体coi基因的变异度。一般认为：二化螟是多食性害虫，但田间主要危害水稻和茭白等少数禾本科植物。二化螟越冬场所复杂，发育进度差异大，发蛾峰期长，不仅难以防治，而且有更多机会寻找繁殖寄主。本研究成果不仅可以对不同虫态进行鉴定，还可以对残缺标本进行鉴定，准确、高效，无需特殊培训。可以使一般植保工作者通过简单的基因片段克隆和测序，准确鉴定不同地区的二化螟，为提高我国的害虫测报水平，甚至害虫测报的自动化提供可靠技术，对保护农业生产安全具有重要意义。

2. 研究的基本内容和问题

研究目标: 建立螟虫的简易分子鉴定方法，本研究首先以分布最广泛的水稻螟虫二化螟为代表虫种，克隆并比较螟虫不同地理种群及个体之间的线粒体coi基因的变异度。

研究内容: 通过剥查水稻枯心株和白穗株，分别在吉林、安徽、浙江、湖北、湖南和四川等地采集二化螟幼虫，按二化螟的形态特征镜检确定后，每个地理种群随机选取5~10头作为试虫，进行线粒体coi基因的克隆和分析研究。

拟解决的关键问题：设计克隆二化螟co1基因的引物，并建立稳定的pcr扩增条件。

3. 研究的方法与方案

研究方法：

1) DNA的提取

采用QIAGEN DNeasy Blood Tissue Kit试剂盒提取总DNA

（1）将约25 mg虫体转入1.5 ml 的离心管中加入液氮研磨，加入180 μl缓冲液ATL，做好标记；

（2）加入20 μl 蛋白酶K，涡旋震荡样品混合均匀，56 ℃ 温浴过夜，直至组织完全细胞溶解；

（3）转速2000g，离心5 min，小心吸取上清液至一个新的1.5 ml离心管中，弃去沉淀；

（4）涡旋15 s，在样品中加入 200 μl缓冲液AL后涡旋混合，然后加入200 μl 乙醇（96%-100%）再次涡旋混合；

（5）将（4）中混合物用移液枪加入到一个有DNeasy Mini spincolumn（柱）的2 ml收集管中，转速≥6000 g，离心1 min，弃去滤液和收集管；

（6）将DNeasy Mini spincolumn（柱）放入一个新的2 ml收集管中，加入500 μl缓冲液AW1，转速≥6000 g,离心1 min，弃去滤液和收集管；

（7）将DNeasy Mini spincolumn（柱）放入一个新的2 ml收集管中，加入500 μl缓冲液AW2，转速≥20000 g，离心3 min，弃去滤液和收集管；

（8）将DNeasy Mini spincolumn（柱）放入一个干净的2 ml离心管中，用移液枪取200 μl缓冲液AE直接加在DNeasy膜上，在室温下温育1 min，转速≥6000 g，离心1 min，保留滤液；

（9）取（8）滤液直接加在DNeasy膜上，转速≥6000 g，离心1 min；

（10）收集（9）滤液 -20 ℃保存备用。

2) PCR扩增

扩增引物参考Folmer所使用的LCO-1490 和HCO-2198 (Folmer et al, 1994)。

上游引物LCO-1490（5'-GGTCAACAAATCATAAAGATATTG-3')

下游引物HCo-2198 （5'-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3')

使用 rTaq 酶进行PCR反应：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性1 min，退火1 min，72 ℃延伸1 min。循环39次，最后72 ℃延伸10 min，12 ℃保存。1.5%琼脂糖电泳鉴定PCR产物，EB染色，紫外灯下观察电泳结果，利用Gel Doc2000凝胶成像系统拍照保存。

3) PCR产物的克隆测序

PCR产物经回收和纯化后，与T3载体进行连接。经转化后挑取重组质粒经菌液PCR检测后，取适量送至上海Invitrogen公司进行测序，使用的仪器为ABI3730测序仪。

4) 序列分析

将测序结果导入DNAStar 中的SeqMan 软( Parchman et al.，2010) ，进行序列的拼接与手工校正，确定分析的序列，利用NCBI 中的BLAST软件进行相似性检索，确定序列方向及目的片度; 将确定的序列载入Clustal X 1.83 软件( Chenna et al.，2003) 进行序列比对，输出格式为FASTA。比对结果导入Mega 5.0 软件( Kumar et al．，2008) ，计算各物种间的遗传距离，转换和颠换值及其比值( R值) ，保守位点( conserved sites，C) 及变异位点( variable sites，V) 等数值; 同时，利用Mega 5.0 构建基于Kimura2-parameter 遗传距离模型的邻接法( Neighbor-Joining，NJ) 系统发育树。

技术路线：

可行性分析：COI基因具有一下特点：(1)大多数细胞中都有上百个以上的线粒体，每个线粒体都有一组染色体，因此等量的样品中线粒体DNA比细胞核DNA更容易被放大和使用；(2)线粒体DNA的突变速度是核DNA的10倍，利用线粒体DNA更容易识别物种的变异；(3)线粒体属母性遗传，很少发生基因重组； (4) 动物生命中绝大部分阶段都存在明显的COI基因序列，COI基因和其他蛋白编码基因一样，其密码子第3位碱基不受自然选择压力的影响，可以自由变异； COI不仅具有足够的变异信息，同时又有较好的序列保守性，很容易被通用引物扩增；很少存在序列插入和缺失现象，使序列比对容易操作；拥有较多的系统发育信号，因此用该基因序列来分析二化螟不同地理种群及个体之间的变异度是可行的。

4. 研究创新点

由于昆虫的传统形态学分类鉴定专业性强，对材料要求较高。此外，大多数昆虫在不同的发育阶段，形态结构变化很大，同种昆虫也会因为地理分布不同产生形态差异，因此根据形态学直接进行昆虫鉴定有时会比较困难，尤其是近缘种的幼体(卵、幼虫、蛹)，形态非常相似，很难对其进行快速、准确的鉴定。而本课题利用发展较迅速的DNA条形码鉴定技术，并选定线粒体DNA CO1基因作为核心序列，能够对各种生物进行快速、准确、自动化标记。

5. 研究计划与进展

2013.8-2013.11

采集10不同地域的二化螟，进行dna提取，克隆，测序。

2013.11 -2014.3