大豆花叶病毒CP基因RNA干扰植物表达载体的构建开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

本课题的意义：

大豆起源于中国，是重要的油料作物，也是人类主要的植物性蛋白来源。在我国，大豆在其生长过程中受到多种病虫害的影响，而大豆花叶病毒（soybean mosaic virus，smv）病是危害最大的病害之一，严重危害大豆的产量和品质。培育和推广抗病品种是防治smv最经济有效的手段，但是传统育种方法周期较长，培育的抗病品种抗谱较窄且抗性容易丧失。转基因技术的发展使得培育具有广谱抗性的品种以避免品种抗性丧失成为可能。

国内外研究概况：

2. 研究的基本内容和问题

研究的目标：

构建干扰载体pb7gwiwg2(ii)-cpi，通过遗传转化技术，将smv cp基因保守序列导入大豆，培育转基因抗smv材料。为利用rna干扰技术改良大豆对大豆花叶病毒的抗性奠定了基础。后代中筛选稳定遗传的高抗smv转基因大豆纯合体，为大豆花叶病毒抗病育种提供新的广谱抗病亲本材料。

研究的内容：

3. 研究的方法与方案

研究方法：

本实验主要场所为国家大豆改良中心，实验室按要求配备了实验所要求的先进仪器。因此，研究方法主要有实验法、文献研究法和实证研究法。 技术路线:

前期：阅读相关参考文献，了解构建载体方法和技术要点。

中期：CP基因保守序列的确定及克隆。提取感病品种的总RNA进行反转录合成第一链，对SMV株系的CP基因进行核苷酸序列比对确定保守区域，利用Primer premier 5.0设计SC3株系保守序列的正反向引物，用该对引物和KOD FX高保真酶以反转录后的cDNA为模板进行PCR反应。PCR产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳检测，用AXYGEN试剂盒对目标条带进行胶回收获得基因片段attB-CPi。

后期：RNAi载体的构建。首先进行BP反应使目的片段连接到入门载体pDONR221，对长出的单克隆扩繁并进行PCR扩增，提取阳性克隆菌液的质粒pDONR221-CPi。然后进行LR反应，LR反应产物转化DH5a后，在含有100 mgL^-1壮观霉素的LB平板上培养过夜，PCR鉴定为阳性的单克隆菌液抽提质粒pB7GWIWG2(II)-CPi。

末期：RNAi载体的鉴定。对重组质粒进行Xba I单酶切和EcoR I、Hind III双酶切，验证在表达质粒的两个位点是否均插入了CPi基因片段。

可行性分析：

1.对抗SMV大豆转基因系统进行优化在研究和实用方面都意义重大；

2.利用RNAi原理构建的干扰载体pB7GWIWG2(II)-CPi省去了传统的酶切连接等步骤以及繁琐的筛选工作，减少了转基因实验开展前的准备工作；

3. 通过基于RNAi的大豆转基因技术培育出对SMV具广谱抗性新种质，这对大豆花叶病毒抗病育种工作有重要意义；

4.各方面现有条件都可以满足实验要求。

4. 研究创新点

1、 虽然通过转基因手段培育SMV抗病品种已有报道，但均是转化CP基因的表达载体，应用RNA干扰技术的研究还未见报道。

2、 利用RNAi原理的农杆菌介导大豆子叶节方法培育转基因植株，后代中筛选稳定遗传的高抗SMV转基因大豆纯合体，为大豆花叶病毒抗病育种提供新的广谱抗病亲本材料。

5. 研究计划与进展

研究计划:

预期进展

1、 确定CP基因保守序列；

2、 对CP基因保守序列进行克隆；

3、 获得干扰载体pB7GWIWG2(II)-CPi；

4、对干扰载体pB7GWIWG2(II)-CPi进行鉴定。