扩展蛋白调控植物叶片发育的研究进展开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

一、课题研究目的和意义

扩展蛋白属于细胞壁蛋白，是一类重要的功能蛋白，它存在于多种植物组织中，主要作用是疏松细胞壁，缓解细胞压力和促进细胞伸长。扩展蛋白基因隶属于一个基因大家族，在此家族中一共有4个亚家族，它们分别是：α–扩展蛋白、β–扩展蛋白、扩展蛋白类似蛋白A和扩展蛋白类似蛋白B，植物中的扩展蛋白主要有两类，即α–扩展蛋白与β–扩展蛋白。众多研究报表明，扩展蛋白几乎参与了植物发育的整个过程，不同的家族成员在植物不同的发育阶段有着不同的作用。因此，分析扩展蛋白不同家族成员在植物生长发育中的作用对于分子育种具有十分重要的意义。因此我们对高羊茅不同的扩展蛋白基因表达水平与多种处理条件下高羊茅叶片伸长速率之间的关系进行研究。

对于扩展蛋白的序列和功能研究，目前主要集中于农作物和经济作物中，涉及的性状多与植物的生长发育有关。草坪草作为绿化不可或缺的植物，在生态体系中具有重要的地位，并且草坪草种质资源丰富，遗传背景多样，是开展扩展蛋白功能研究的优良材料。高羊茅是我国从国外引进的冷季型草种。高羊茅具有色泽深绿、叶片纤细、耐寒耐旱、苗期生长快等特点，无论是做牧草还是草坪草都有很高的利用价值。作为草坪草使用时，叶片特性为评价草坪草质量的重要指标，叶片的生长发育、伸长速率等因素对草坪整齐度、均一度、美观性等都有很重要的影响。已知扩展蛋白具有促进植物叶片伸长的功能，因此研究扩展蛋白与高羊茅叶片伸长的关系具有重大的现实意义。

二、研究概况

1.扩展蛋白的研究概况

扩张蛋白基因已在多种植物种被鉴定存在，而越来越多基因的克隆和相关功能的研究分析表明，扩展蛋白（特别是α-扩展蛋白）几乎参与了植物的整个生长发育过程，包括种子的萌发、根毛的起始和延长、茎和叶的生长发育、叶柄的脱落、花粉管的延长、果实的成熟等，近几年来在植物抗逆性过程中，也陆续发现了一些扩展蛋白基因的参与。β–扩展蛋白的功能主要集中于花粉管的延长等领域，而γ-扩展蛋白数量分布较少，有关功能的研究鲜有报道。

对于植物来说，细胞壁是一个重要的结构，细胞壁的增大是植物形态建成一个很重要的决定因素，因此细胞壁的伸展机理一直是一个研究热点。截至目前为止，关于扩展蛋白的基因家族、结构、特性、伸展机理都有了一定的研究深度，而且在不同的种属植物上已作了大量的基因克隆。

扩展蛋白的最初研究是在1989年Cosgrove对黄瓜下胚轴细胞壁酸诱导伸展的研究中得以体现的，经过研究他得出一个结论：细胞壁蠕变依赖于一种酶，这种酶与细胞壁牢固结合或缠绕，但是他也表示这种设想要通过提取和重组细胞壁试验进一步证明。McQueen–Mason等人在1992年通过从黄瓜幼苗下胚轴中分离纯化出两种细胞壁活性蛋白（分子量为29kDa、30kDa）验证了这一结论。但此次提取出的蛋白特性与以往有所不同，它的蛋白粗提液具有诱导体外热钝化细胞壁的伸展的功能，并会受到PH和金属离子等因素的影响。Shcherban等人在1995年，通过克隆前述两种扩展蛋白的cDNA序列，进行Northern印迹杂交，得出在下胚轴的生长区表达量高，而在非生长区进行表达。在此之后，经过大量研究，许多研究人员相继在燕麦胚芽鞘细胞壁、番茄叶片、栝楼根尖细胞壁及玉米根部等组织中鉴定出不同的扩展蛋白。随着基因测序技术的发展，越来越多的扩展蛋白序列得到鉴定，使扩展蛋白的基因家族成员越来越多，功能也随之丰富了起来。

2.草坪草与牧草叶片的研究概况

（1）叶片对于牧草和草坪草的重要性

草坪是在园林中采用人工铺植或草籽播种的方法，培养形成的整片绿色地面，是园林风景的重要组成部分，同时也是休憩、娱乐的活动场所。现代草坪主要用禾本科草，把用于建植草坪的禾本科草称为草坪草。草坪草是用多年生矮小草本植株密植，并经人工修建的草地。根据其地理分布和对温度的适应性，分为冷季型和暖季型两大类，按用途可分为游憩草坪草、观赏草坪草、运动场草坪草、交通安全草坪草和保土护坡草坪草。现在世界范围内的草坪草有100多种。

叶片常常作为研究草坪草生长发育的重要指标之一。草坪草叶内含有叶绿体，是植物进行光合作用的主要器官，同时蒸腾作用也是通过叶子的气孔实现的。叶片的各项指标不仅影响草坪草的生长发育，而且影响草坪的质量。叶片的长度、颜色、密度、质地、均一度、盖度、绿期等都会对草坪的质量产生重要的影响。

牧草，一般指供饲养的牲畜使用的草或其他草本植物。牧草再生力强，一年可收割多次，富含各种微量元素和维生素，因此成为饲养家畜的首选。作为牧草的条件最好是具备生长旺盛草质柔嫩、单位面积产量高、再生力强、一年内能收割多次、对家畜适口性好、营养上含有丰富的优质蛋白和长骨骼所必需的适量的磷钙及丰富的维生素类等。牧草叶片的好坏往往是决定牧草质量的关键因素。叶片的营养成分、质地、适口性、消化率等都是衡量牧草品质的指标。

叶片不仅影响光合作用和蒸腾作用，也影响产量。不管高羊茅作为草坪草，还是作为牧草，对于其叶片的研究始终在生产实践中具有重要的意义。

（2）叶片的伸长

叶片伸长率(LER)由细胞伸长和细胞分裂两个方面决定(Green，1976)。而细胞的伸长和分裂均是在叶片伸长区发生，这个区域位于叶片基部，被包裹在老叶片的叶鞘内。叶片伸长受植物基因和发育情况的调节，随着植物叶片的年龄和位置的不同而不同。不同基因型的植物LER差异显著。有些植物中，品种间LER的差异是由细胞伸长和分裂两个方面共同决定。研究发现，在高LER型的高羊茅中表皮细胞长度(26mn/d)比低LER型的高羊茅品种(18mm/d)长约25%，而细胞产生速率则高出约24%。这说明不同基因型间LER的差异既与细胞长度有关，也受到细胞产生速率的影响。

由于生产目的的不同，在植物改良过程中，有时需要培育快速增长的品种，有时则要选择生长缓慢的品种。例如，对多年生草种而言，生长迅速是饲料牧草或天然草原的理想特性( Wang etal，2002 )，尤其是作为生物能源来开发(Brosse etal，2012)，而对于需要修剪的草坪而言，则需要选择生长缓慢的品种(Fagernessetal，2000。因此，了解控制叶片伸长的机制，对遗传改良和分子育种至关重要。

已有研究表明，高羊茅不同基因型植株叶片伸长速率差异显著，而叶片伸长速率的差异与叶片细胞的伸长和分裂密切相关，不同高羊茅品种生长速率的差异与表皮细胞的长度和生成速率均相关。

3.扩展蛋白调控叶片发育的研究

研究表明，不同的扩展蛋白在叶片发育的不同阶段有不同的功能。在2000年， Cho等将AthEXP10基因转移到拟南芥中，利用35SCaMV强启动子启动该基因的表达，发现在5d大小的转基因苗中，基因的表达部位位于第一片真叶的基部而非子叶；在29d的转基因苗中，基因表达的部位位于叶柄和中脉处，在叶子表皮毛基部、叶梗脱落区也有大量表达，但在叶子中没有表达。此外，比较正义和反义表达的转基因植株发现，正义表达植株扩展蛋白基因的转录增加，叶片长度、宽度和叶柄长度都有所增加，显示扩展蛋白通过胞壁流变学作用控制叶片形状，在细胞壁松弛的基础上调控叶细胞的生长，而反义表达的转基因植株，叶片明显缩小，叶片长度、宽度和叶柄长度减小，并沿中脉旋转呈现畸形，可能是由于叶片和中脉生长的不协调所致。Stephane 于 2001年研究发现，扩展蛋白基因 CsEXP1 在黄瓜幼苗顶端分生组织表达可导致叶片组织异常，叶片脉络呈卵形，甚至叶序方向也发生变异，植株形成起始时叶序呈反时针方向，随后才形成正常的顺时针方向的叶序。

Cosgrove 等发现，外源扩展蛋白可诱导非分化细胞转化成为叶片细胞，生成类似叶子的结构，新 “叶”模仿正常叶片生长的模式，有规律的生于茎上并行使叶片功能。Fleming 等研究发现，局部应用扩展蛋白可诱导番茄分生组织产生不正常的叶原基，但这些叶原基不能进一步发育成正常的叶片。2001年，Stephane等发展了一种新的检测技术，以研究扩展蛋白在叶子生长发育中的作用。该技术通过对转基因植株的短暂局部微诱导，使扩展蛋白基因在转基因植物中的特定位点得到瞬时表达。结果发现，扩展蛋白基因在叶原基部位的特定表达能够诱导一个信号程序或传导途径，并因此启动叶子的形成。对正在发育的叶原基侧面的微诱导显示，扩展蛋白基因的表达能够导致叶片形状的改变。

三、研究前景

扩展蛋白作为植物细胞壁的重要组成成分，其主要作用方式是疏松植物细胞壁的组分，增加细胞壁的柔韧性，这一特征决定它参与了植物细胞生命活动的许多过程。近些年来，随着抗逆性分子生物学研究的深入，陆续发现其在耐热、抗旱、抗病等抵御逆境方面也起着非常重要的作用。当植物处于逆境胁迫时，通过细胞壁中扩展蛋白的积累，疏松细胞壁的组分，增加细胞壁的柔韧性，可以舒缓 逆境造成的压力，维持细胞的基本形态。植物这种被动式的抵御逆境胁迫的现象不仅为扩展蛋白的功能赋予了更多的新含义，也为抗逆的分子生物学研究开辟了新思路。相信随着对扩展蛋白作用机制研究的探索和深入，将有可能为植物生长发育新的理论依据，会有更多扩展蛋白的功能被发现并被应用到实践当中。

通过对高羊茅中叶片伸长相关扩展蛋白基因的表达水平进行了多角度的考察，鉴定出与高羊茅叶片伸长密切相关的扩展蛋白基因，并进一步测定基因在叶片不同部位的表达水平，确定不同品种中调控叶片不同部位伸长速率的相关基因，克隆其启动子，对上游元件进行分析，确定扩展蛋白对高羊茅叶片生长的调控机制。为未来草坪草生长发育的研究提供了思路，也为未来草坪草抗逆等特性的研究提供了理论基础。

2. 研究的基本内容和问题

一、研究目标

本实验在扩展蛋白调控植物生长发育研究进展的基础上，运用实时荧光定量pcr技术原理和测定方法，对高羊茅不同的扩展蛋白基因表达水平与多种处理条件下高羊茅叶片伸长速率之间的关系进行研究，以期为扩展蛋白基因调控草坪草生长发育机理研究实验提供更便捷直观的理论依据。

3. 研究的方法与方案

一、研究方法

1.确定2种叶片伸长速率不同的高羊茅品种

（1）根据株高获得株高较高及较低的高羊茅材料各10份；

4. 研究创新点

对于扩展蛋白的序列和功能研究，目前主要集中在农作物和经济作物中，涉及的性状多与植物的生长发育有关。在草坪草领域研究扩展蛋白调控叶片伸长的研究尚且不多。作为绿化不可或缺的植物，草坪草在生态体系中具有重要的地位，并且草坪草种质资源丰富，遗传背景多样，是开展扩展蛋白功能研究的优良材料。因此该项研究具有广阔的应用前景，也为其他扩展蛋白调控草坪草生长发育的其他相关研究提供了理论依据。

5. 研究计划与进展

一、研究计划

2019年4月—2019年6月 筛选出叶片伸长速率不同的高羊茅品种；

2019年7月—2019年9月 获得高羊茅扩展蛋白基因家族信息，完成基因表达水平测定；