mTOR抑制剂RAD001对RKO细胞凋亡的影响开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

结直肠癌（crc）严重危害人类的健康，每年都有超过100万新发病例，而且还会有60多万人因此死亡[1]。

在美国，crc在恶性肿瘤排行榜上名列三甲 [1]。

由于绝大多数患者确诊时病情已经发展至中晚期或已发生转移，难以进行手术切除，以致结肠癌患者存活率很低。

2. 研究的基本内容和问题

1.项目研究目标1.1本实验探究哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mtor)抑制剂rad001对rko细胞凋亡的影响，以及细胞凋亡相关基因及caspase3/8/9的表达。

1.2掌握细胞凋亡相关理论及分析方法，熟悉细胞培养方法及科研思路。

2.项目研究内容2.1细胞体外培养用mccoys5a培养液处理rko细胞，在5%co2培养箱中进行培养；2.2诱导细胞凋亡用不同浓度rad001处理rko细胞，使其产生细胞凋亡，通过观察细胞生长和检测细胞凋亡，确定rad001诱导rko细胞细胞凋亡的最佳浓度；2.3观察细胞生长用rad001诱导rko细胞凋亡，培养48h，然后染色细胞，观察细胞生长情况；2.4分析细胞凋亡用rad001诱导rko细胞凋亡，培养48h，收获细胞，分别用hoechst33258染色和流式细胞仪检测rko细胞凋亡情况；2.5检测细胞凋亡的下游反应──caspase活性在体外培养的rko细胞中，用western-blot方法检测caspase 3/8/9变化；2.6检测mtor通路及细胞凋亡相关基因的表达用rad001诱导rko细胞凋亡，培养24h，收获细胞，分别用real-time pcr和western-blot检测s6和dr5的表达。

3. 研究的方法与方案

4.研究方法本实验利用rko细胞作为研究对象，采用hoechst33258染色和流式细胞仪检测细胞凋亡，用western-blot检测caspase活性，和western-blot、real-time pcr方法分别检测s6和dr5蛋白及mrna水平的表达变化情况。

4.1对rko细胞解冻，用mccoys5a培养液进行细胞培养；4.2用不同浓度的rad001处理rko细胞，用hoechst33258染色和流式细胞仪方法确定rad001诱导rko细胞凋亡的最佳浓度；同时，用mts法确定细胞生长情况；4.3在mrna水平上，用real-time pcr方法检测细胞凋亡和mtor通路相关蛋白表达；4.4在蛋白水平上，用western-blot方法检测细胞凋亡和mtor通路相关蛋白表达5.技术路线（见附件）6.实验方案6.1细胞的培养在mccoys5a培养液中添加小牛血清和抗生素，使其成为完全培养液，在超净工作台中处理rko细胞。

6.2诱导rko细胞凋亡用不同浓度的rad001（5μm, 10μm, 15μm, 20μm, 25μm）处理rko细胞。

4. 研究创新点

8.特色或创新之处mTOR通路在细胞生长、细胞增殖及能量代谢等方面都具有重要作用，特别在RKO细胞中过度表达引起调控异常，而其抑制剂RAD001已得到FDA批准，因此RAD001对RKO细胞的影响值得研究；同时为RKO细胞靶向治疗提供理论依据。

5. 研究计划与进展

9.研究计划及预期进展2015年5月：查阅文献，撰写综述，确定实验方案；2015年6月2015年8月：培养细胞，诱导细胞凋亡，观察细胞生长和分析细胞；2015年9月2015年10月：检测Caspase 3/8/9变化；2015年10月2015年11月：设计相关引物，进行Real-time RCR实验；2015年11月2015年12月：进行Western-blot实验，检测S6和D R5表达；2016年1月2016年2月：整理数据，统计分析；2016年3月：提交开题报告；2016年4月：总结材料，提交结题报告形成论文；2016年5月：提交论文。

10.预期结果10.1确定RAD001处理RKO细胞的最适浓度；10.2 探究出mTOR抑制剂RAD001对RKO细胞凋亡的影响以及对RKO细胞凋亡相关的特异性基因的表达情况及机理，为RKO细胞癌变的治疗提供参考资料。