体外法研究猪后肠道微生物对菊粉的发酵特性开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

为了增加母猪生产力及栏舍利用率，降低饲养成本，提高生产效益，养猪生产中普遍实行早期断奶。此时断奶仔猪消化系统和免疫器官发育未完善，消化道中正常的微生态系统还未建立完善，断奶后会因仔猪消化能力和抗逆能力差，而导致 仔猪早期断奶综合征，具体表现为：仔猪食欲降低、消化功能紊乱、腹泻、生长缓慢、饲料利用率低、精神状况以及外貌表现不佳等问题。在养猪生产中，仔猪的生长状况直接影响整个生长育肥阶段的成绩，如何减轻与克服仔猪断奶应激，已成为提高养猪生产效益的关键问题。

通常在饲料中添加抗生素来减少因环境变化造成的应激和预防早期断奶仔猪腹泻，同时有较好的促生长作用，但在养猪生产中使用大量的抗生素可能会引起仔猪肠道菌群失调。抗生素用量及种类使致病菌抗药性增强，动物体内药物残留加剧等问题日益引起人们的重视，世界各国正逐步限制或禁止在饲料中使用抗生素。1999年，瑞士禁止使用饲用抗生素；2006年1月，欧盟全面禁止抗生素作为饲料添加剂^[4]，随着我国饲用抗生素使用的规范，仔猪腹泻将面临更大的挑战。因此，寻找抗生素替代品来减少其使用量，同时保证养猪生产效益的研究具有重要的意义。

菊粉是植物中含有的天然果聚糖类碳水化合物，属于植物中储备性多糖，其作为一种化学益生素，水解最终产物是果糖，作为有益微生物底物，是一种新型的饲料添加剂，可选择性促进有益菌生长。同时在动物体内无残留，不产生抗药性且可以改善动物的脂肪代谢，提高矿物质的吸收利用。在日本，有40 %的仔猪饲料添加了寡聚糖，而且这类产品在亚洲、加拿大、欧洲的生产和使用都呈上升趋势。可见，菊粉作为一种功能性饲料添加剂，扩展了传统上碳水化合物仅作为能源物质的功能，已成为动物营养研究的新动向，具有成为抗生素替代品的潜力。

2. 研究的基本内容和问题

研究目标：

利用体外发酵模型研究菊粉对猪后肠道微生物发酵功能的影响，从而为菊粉在饲料添加剂中进一步应用提供参考。

研究内容：

3. 研究的方法与方案

研究方法：

1.建立体外厌氧发酵体系

2.测定发酵指标

技术路线：

见附件

实验方案：

1.建立体外厌氧发酵体系

参照《An in vitro batch culture method to assess potential fermentability of feed ingredients for monogastric diets》中的方法进行培养基的配置并建立体外厌氧发酵体系。

根据上表方案进行分组，每组4个重复。

2.测定产气量

根据上述时间点测定产气量。

3.pH值测定

利用pH计测定0h、24h的pH值。

4.NH₃-N测定

1.试剂：亚硝基铁氰化钠；苯酚；NaOH；Na₂HPO47H₂O（或Na₂HPO412H₂O）；次氯酸钠溶液；硫酸铵；盐酸；蒸馏水；苯酚溶液：将0.15g亚硝基铁氰化钠溶于1500ml蒸馏水中，然后加入33ml苯酚（90%W/V）充分混匀，最后将溶液稀释到3000ml，置于棕色瓶中保存备用；次氯酸钠溶液：将15gNaOH溶于2000ml蒸馏水中，再加入113.6gNa₂HPO47H₂O (151.8g Na₂HPO412H₂O)。冷却后加入150ml次氯酸钠溶液（5.25%），将溶液定容到3000ml。用快速滤纸过滤后放入棕色塑料瓶中保存。

2.标准液的配制：

称取0.6607g硫酸铵（经100℃烘12h）溶于0.1N盐酸并定容至100ml，得到100mM的标准氨溶液。用0.1N盐酸进行稀释可分别得到1、2、4、6、8mM的标准氨溶液。用0.1N盐酸溶液作空白，在630nm下比色可得到吸光度（Y）与氨浓度（X）的标准曲线。

3.盐酸配制

0.02mol/LHCl溶液：量取1.8毫升盐酸，缓慢注入1000ml水。

　　0.1mol/LHCl溶液：量取9毫升盐酸，缓慢注入1000ml水。

　　0.2mol/LHCl溶液：量取19毫升盐酸，缓慢注入1000ml水。

　　0.5mol/LHCl溶液：量取45毫升盐酸，缓慢注入1000ml水。

　　1.0mol/LHCl溶液：量取90毫升盐酸，缓慢注入1000ml水。

4.操作

4.1加入0.05ml样品（发酵液取0.01mL）（标准）液于试管中（空白为0.1M盐酸溶液）；

4.2边混合边加入2.5ml苯酚溶液；

4.3加入2.0ml次氯酸钠溶液并摇匀；

4.4将试管置于95℃水浴5min；60℃水浴10min。

4.5取出冷却后于700nm、下比色，或者取200ul到酶标仪上，直接进行测定，记录吸光度。

5.MCP测定

5.1试剂：

5.1.1 0.25N NaOH溶液==0.25mol/L NaOH==40g/mol X 0.25mol/L==1g/100mL

5.1.2 0.1mg/mL的牛血清蛋白（BSA）

5.1.3考马斯亮蓝（G250，95%乙醇，85%磷酸溶液，双蒸水）

5.2考马斯亮蓝的配置：

10mg考马斯亮蓝G250，溶于5mL 95% 乙醇（保证充分溶解）

然后加入10mL 85% 磷酸溶液（w/v）（浓磷酸），最后用双蒸水定容到100mL

过滤后使用，4℃避光保存，保质期为1周。（看准是G250还是R250）

5.3步骤：

取1mL发酵液，4℃离心1,000-800 rpm，8min吸取上清液100uL于1.5mL离心管中，15,000转，4℃离心15min弃上清，底物中加入300uL 0.25 N NaOH，混匀

100℃水浴10min，4℃离心15,000转，30min，吸取上清液20uL于酶标版中，加入200uL考马斯亮蓝，混匀于595 nm处用酶标仪测定。

5.4制作标准曲线：

按下表在酶标版中加入各种试剂

混匀后，室温放置2min

在酶标版上比色（595nm）分析

5.VFAs测定

用高效气相色谱法测定VFAs。

可行性分析：

1.科学明确的研究思路

菊粉作为一种新型绿色饲料添加剂已具有一定研究基础，本研究旨在通过常规发酵指标评定其在猪后肠的发酵特性。

2.优良的试验与观测条件

南京农业大学消化道微生物实验室于2002年建立，是江苏省重点研究室。实验室具有本实验配套的技术和设备，给试验的硬件设施带来保证。

3.厚实的研究工作基础

指导老师朱伟云教授多年来从事动物消化道微生物及其营养的研究工作，开发环保型动物饲料添加剂和保健制剂，为促进我国安全畜产品的生产作贡献，积累了丰富的相关知识和工作经验，为本项目的开展奠定了良好的理论和技术基础。

4.合理的科研创新团队

通过不同学科方向的交叉和渗透，消化道微生物实验室多年致力于肠道微生物的研究并取得了巨大的成果，有大量专业人才能给予指导，为项目的顺利完成提供了良好的专业力量保证。

4. 研究创新点

通过自主设计的实验方案，从碳循环、氮循环两方面评定猪后肠微生物发酵菊粉的能力。

5. 研究计划与进展

2017.3-2017.4 体外发酵实验、相关指标测定

2017.4-2017.5 毕业论文撰写、修改