鸡胚胎期肌纤维发育的研究开题报告

1.本课题的意义

我国是世界上饲养家禽最多的国家，随着生活水平的提高，生长快、肉质差的肉鸡品种已经不再受消费者欢迎，市场份额逐年缩小，而肌肉品质优异的肉鸡品种越来越受到消费者青睐。如何在追求生长速度的同时提高肉品质是目前养禽业发展所面临的主要困难之一^[1]。

鸡肌肉的生长发育是肉品质的形成过程中至关重要的一环。以往的研究往往大都集中在肉品表观指标的分析以及宰后肉品的加工上，而对影响肌肉生长发育的分子调控机理研究较少^[2]。肌纤维的特性直接决定鸡肉的品质。吴信生等^［3］(1998)对我国的7种地方鸡种进行组织学研究，结果表明，肌纤维密度与肌肉的嫩度关系密切，7个鸡种均表现为肌纤维愈细，肌纤维密度愈大，肉质越鲜嫩^[4]。肌纤维的生长发育在胚胎期就已经决定，通常与遗传、营养、性别及环境等诸多因素有关，不仅受营养因素的调控，也受到非营养因素以及某些调控因子的调控。本课题选取萨索鸡以及白羽鸡进行肌纤维的发育状况的研究，萨索鸡是一种商品用鸡，生长速度快，鸡肉品质一般，而白羽鸡是一种地方优质品种，生长较为缓慢，肉质较好，比较这两种鸡肌纤维的发育，有助于解释品种间鸡肉品质的的差异，将为我国优良种质资源的保护和开发以及肉产品品质的提高提供的理论依据。

2. 国内外研究概况

Maltin等在1997年发现Ⅱb型肌纤维的直径对肉的嫩度有显著性影响，肌纤维直径与剪切力和滴水损失成正比。韩海霞等对我国地方鸡种的研究表明，肌纤维直径越细，肉质越嫩，肌纤维直径越粗，肉质越硬。Kim等发现Ⅱb型肌纤维的直径和眼肌面积呈正相关，和嫩度呈负相关。以上研究都表明，肌纤维直径的大小和肉的嫩度呈反比。刘冰等研究表明，家禽腿肌和胸肌的肌纤维直径随周龄的增加逐渐增大，其中腿肌纤维在0~2周龄生长速度最快；不同品种肌纤维的生长速度差异较大；同一品种在同一周龄，胸肌肌纤维直径都要小于腿肌。在杂交优势率上，杂交鸡的肌肉纤维直径并没有表现出规律性变化，而是偏向母本，表现出一定的母体效应。陈宽维等研究发现，白肌纤维直径大于红肌纤维直径和中间型肌纤维直径，并且肌纤维直径和密度共同影响肌肉的蛋白质含量。

廖菁等通过研究不同品种鸭肌纤维的发育规律表明，随周龄的增加，肌纤维直径在8周龄前逐渐增大，8周龄时增长速度最快，然后基本保持稳定或有所下降。陈国宏等对肖山鸡、白耳鸡肌肉生长发育规律的研究表明：不同时期（4、8、12周龄）肖山鸡、白耳鸡胸、腿肌肌纤维密度都逐渐降低，尤以8~12周龄下降明显；同一时期、同一鸡种、不同部位，胸肌肌纤维密度大于腿肌肌纤维密度；不同鸡种、同一部位在同一时期，白耳鸡肌纤维密度高于肖山鸡。此外，纤维密度还与生长速度密切相关，快生型畜禽的肌纤维密度高于慢生型（Dransfield等1999）；肌纤维横截面积随日龄的增加而增加，肉禽比蛋禽的大，生长速度快的比生长速度慢的大（Kong等1985）。

Fahey等研究羔羊发现，肌纤维密度与肉品质呈显著正相关，肌纤维密度越大，肉质越嫩。韩海霞等对我国地方鸡种的组织学研究表明，肌纤维密度与肌肉的嫩度相关比较密切，表现为肌纤维密度越大，肉的嫩度越好。计成研究表明，肌纤维直径与嫩度呈负相关，肌纤维密度与嫩度呈正相关，且肌纤维直径与密度呈负相关。因此可认为肌纤维愈细，密度愈大，肉质越鲜嫩^[6]。

3. 应用前景

肌纤维的生长发育期在胚胎期就已经决定，肌纤维的特性决定了肉质的好坏，我们对肌纤维发育的研究能够解释不同品种间的肉质差异，从而选择生长速度快，肉质好的品种作为商业用鸡，不仅能够提高鸡肉的适口性还能对肉产品的发展起到促进作用。肌肉由肌纤维组成，肌纤维的特性是决定肉品质的重要因素。不同类型的肌纤维在收缩特性、代谢特性等方面存在差异，不同类型的肌纤维组成的肌肉之间也存在较大的差异，最终导致了肉品质的差异^[5]。分析肌纤维生长发育规律，进一步研究与肌肉生长机制有关的信号途径，有益于家禽选育过程中对关键基因的选择^[7]。从微观角度的研究一方面可以验证我们对肌纤维的特性的分析，另一方面我们可以找到决定肌纤维发育或者说决定鸡肉肉质的关键因子，有利于进行遗传或者转基因方面的研究，对鸡遗传和育种方面的研究工作有积极的作用。

参考文献：

[1]廖菁.鸡肌纤维生长发育规律及Pax基因遗传效应的研究[D].江苏扬州：扬州大学动物遗传与繁殖，2010.

[2]张锁.鸡Pax7基因多态性及组织表达规律的研究[D].郑州：河南农业大学动物营养与饲料科学，2014.

[3]吴信生，陈国宏，陈宽维，等.中国部分地方鸡种肌肉组织学特点及其肉品质的比较研究[J].江苏农学院学报，1998.19 (4):52-58.

[4]秦召.鸡肌纤维特性及Myogenin基因多态性的研究[D].郑州：河南农业大学动物营养与饲料科学，2007.

[5]闫俊书,周维仁,宦海林,等.家禽肌纤维的生长发育规律及其调控[J].江苏农业科学,2010(5):276-279.

[6]辛雪，苏琳，靳烨.肌纤维及其相关基因对肉品质的影响[J].食品工业. 内蒙古农业大学食品科学与工程学院.

[7] S.G.Velleman.家禽孵化期胚胎肌肉发育研究进展[J].中国家禽，2010（5）：44-49

研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析

（1）总RNA提取：

I.去不同时期肌肉组织样品，液氮研磨后加1 ml Trizol到细胞（210⁶PGC）中，反复轻轻吹打，室温静置5分钟后，转入1.5 ml EP管；

II.每EP管加入200 μl氯仿，在漩涡器上剧烈振荡15-30秒，充分混匀。

III.在4℃下，12,000 rpm离心15分钟，离心后管内分三相：下层红色的酚相，中间层为氯仿相，上层为无色的水相；

IV.RNA沉淀：小心吸取400 μl上层水相至DEPC处理过的EP管中，加入等体积的异丙醇，室温放置15分钟，4℃，以12,000 rpm离心10分钟；

V.弃去上清，用1.5 ml 75%的乙醇清洗沉淀，剧烈震荡，于4℃以7,500 rpm离心10分钟，用微量移液器尽可能将乙醇吸尽，于超净台内放置风干（15分钟左右，切记不可让RNA沉淀过度风干）；

VI.总RNA浓度的测定：用紫外分光光度计（Nanodrop）检测OD260及OD280的值，计算RNA的浓度及OD260/OD280的比值。OD260/OD280（A260/280）可以反映RNA的纯度，1.8～2.1为纯度良好。总RNA浓度（mg/ml）= OD260 40 稀释倍数。

VII.总RNA完整性检测：取2 μl总RNA提取液，用1.5% 琼脂糖凝胶进行电泳（电泳槽，制胶板应先经甲醛处理），观察RNA提取情况，判断RNA的完整性。完整的真核细胞总RNA可见到28 S、18 S两条带。

（2）cDNA的合成：

I.取一灭菌的无RNA酶的EP管，加入1 μg RNA模板和1 μl Oligo (dT) 引物，再加入适量 DEPC水至12 μl；

II.稍离心，70℃水浴5 min，迅速置于冰上冷却至室温；

III.依次加入1 μl的RNA酶抑制剂、4 μl的5Reaction buffer、2 μl的dNTP，稍离心沉淀液体，37℃水浴5 min；

IV.加入M-MLV反转录酶（200 U/ml）1 μl，稍离心；

V.42℃水浴60 min， 70℃水浴5 min终止反应；冰上迅速冷却，所得引物即为cDNA。

（3）用Primer 5.0软件设计引物，送至上海生工生物工程技术服务有限公司合成，引物序列及产物长度等如表2-1所示。引物用灭菌的ddH₂O稀释至100 μM浓度，于-20℃储存；使用浓度为10 μM，4℃放置。

（4）PCR的扩增，反应体系为20 μl

1)反应条件：

2)琼脂糖凝胶电泳

取5 μl PCR扩增产物，在1.5% 琼脂糖凝胶上进行电泳（100 V, 1 h）。Tanon凝胶成像系统观察并拍照。

（5）鸡胚肌肉组织切片的制作

固定：4%甲醛固定至少24小时

流水冲洗3小时以上(过夜)

脱水：50%酒精3小时以上（可以在里面过夜）

70%酒精2小时以上（可以在里面过夜）

80%酒精2小时（或在里面过夜）

95%酒精Ⅰ1小时

95%酒精Ⅱ1小时

100%酒精Ⅰ30分

100%酒精Ⅱ30分

透明：二甲苯酒精1：1溶液 15分钟或稍长

二甲苯I 10分钟（建议稍微长一些，大部分发亮为标整）

二甲苯II 5分钟

包埋：二甲苯石蜡1：1 15分钟

石蜡Ⅰ 1小时

石蜡Ⅱ 20分（建议：如浸蜡不好时间可以稍长一些）

注意：培养的是不是很小，就必须减少时间。

切片贴片：厚度5-10微米，48到60度之间的水温贴片。60烤片8h

HE染色：

脱蜡 ： 二甲苯Ⅰ 6分钟

二甲苯Ⅱ 6分钟

浸水： 100%酒精Ⅰ 4分钟

100%酒精Ⅱ 4分钟

90%酒精 3分钟

80%酒精 3分钟

70%酒精 3分钟

蒸馏水 3分钟

染色： 苏木精染液 20分

自来水冲洗2分钟左右

酸水分色 （0.5m HCL） 15s 提3下左右（1%的盐酸和70%的酒精）

自来水浸泡 30分钟左右 兰化

脱水： 70%酒精 3分

80%酒精 3分钟

90%酒精Ⅰ 3分钟

伊红30s-60s

95%酒精Ⅱ 30S

100%酒精Ⅰ 3分钟

100%酒精Ⅱ 3分钟

透明： 二甲苯Ⅰ 5分钟

二甲苯Ⅱ 5分钟

封片

（5）鸡胚性腺组织的冰冻切片

将不同发育阶段的胚胎以4％多聚甲醛室温固2小时，经15％蔗糖 2％多聚甲醛脱水4-6小时，30％蔗糖梯度脱水4-6小时。待胚胎沉底后，用OCT包埋，冰冻切片（厚10 μm）。室温晾干，-80C保存。

（6）免疫荧光染色

I.收集切片，在PBS中洗3遍；

II.10% 山羊正常血清37℃封闭30分钟，不洗；

III.加一抗PAX3, 4℃过夜；

IV.PBS洗3次后滴加荧光二抗羊抗鼠IgG FITC（1：1000），37℃，避光孵育30分钟；

V.PBS洗3次后，加入DAPI溶液，5分钟，PBS洗3次；

VI. 添加防荧光淬灭剂，荧光显微镜下观察，拍照。

可行性分析：

肌纤维的直径大小和密度会影响肌肉的嫩度，而肌纤维的发育情况是在胚胎期就决定的，所以我们研究胚胎期肌肉发育的特性，在一定程度上可以反映成体的肉质。同时肌纤维的形成受成肌因子的调控，所以检测成肌因子的基因表达情况会反映肌纤维发育的潜能和趋势，从而验证我们对肌纤维发育的研究。

研究计划及预期进展

2016.52016.7

（1）实验的前期准备，资料检索，优化实验方案。

（2）种蛋孵化，取不同胚龄鸡胚骨骼肌组织进行切片，HE染色比较品种间不同胚龄鸡胚骨骼肌的形态差异。

2017.22017.5

（1）利用石蜡切片的方法进行HE染色，得到比较清晰的片子，综合观擦分析肌纤维并测得所需的肌纤维特性的数据，记录数据。

（2）数据分析，主要运用Excel进行比较分析，以及运用数据分析软件得到差异示图，易于分析。

（3）理论总结；撰写相关论文，提交结题报告。

预期研究成果

（1）揭示鸡肌纤维在胚胎期的生长发育规律。

（2）品种间骨骼肌发育过程中PAX3的差异表达，进行验证研究。