恶臭假单胞菌B6-2中毒素抗毒素系统同源基因的功能研究开题报告

1. 研究目的与意义

研究背景：多环芳烃和二恶英是在自然环境中广泛分布的有机污染物，具有高毒性和高致癌性。通过垃圾焚烧、化石燃料等不完全燃烧产生，一旦进入人体内，就会在体内长时间积累，严重危害了人体健康。本文研究的恶臭假单胞菌b6-2菌株能够以联苯为唯一碳源生长，通过共代谢的方式降解pahs和dioxins的代谢产物。毒素抗毒素(ta)分子是一类广泛存在于原核生物中的小遗传元件，原核生物能够通过这一基因元件控制细胞的代谢水平、介导细胞程序性死亡以及抵御噬菌体侵染等行为。根据抗毒素作用机制，将ta系统分成6类，即i型至vi型，其中ii型ta系统研究最为深入和广泛。ii型ta系统毒素和抗毒素都是小型不稳定的蛋白质。抗毒素蛋白有两个结构域，一个与dna结合，另一个在毒素与抗毒素基因共转录翻译完成后，直接与毒素蛋白相结合，形成的复合物可以抑制毒素蛋白的活性。在胁迫条件下，抗毒素蛋白易被蛋白酶水解，从而激活毒素蛋白，导致细胞生长停滞，形成持留菌。此外，ta系统还有逐级调节细菌生长速度；维持细胞内的质粒的稳定遗传；参与细胞被膜的形成以及防御病毒的感染等功能。

2. 研究内容和预期目标

研究内容：前期在b6-2菌株中同时敲除毒素和抗毒素蛋白以后，启动子活性反而降低这一实验现象，推测可能存在其他阻遏蛋白在调控启动子活性。本文基于此，通过同源重组实现基因敲除，构建p. putida b6-2△relbⁿ(pme6522-p_relb)和p. putida b6-2△relberelbⁿ(pme6522-p_relb)突变株，通过利用miller的方法，比较各菌株间的启动子活性来研究证实relbⁿ能够发挥一定的阻遏作用的猜想。

预期目标：菌株p. putida b6-2(pme6522-p_relb)启动子活性的数值和p. putida b6-2

3. 研究的方法与步骤

(1) 重组片段的获取：根据恶臭假单胞菌b6-2基因组，克隆目标基因relbⁿ上下游的片段，进行重组连接并通过pcr扩增；利用琼脂糖凝胶电泳的方法检测pcr产物，若成功，则进行pcr产物的回收。

(2) 构建重组质粒：按照试剂盒上的说明方法，提取质粒；将质粒酶切后切胶回收，在紫外灯下找到酶切片段，回收质粒酶切产物；将目的基因relbⁿ的上下游片段与线性化的质粒用诺唯赞试剂盒进行重组；制备感受态细胞进行转化实验；挑选转化子并用电泳验证；

4. 参考文献

[1] 尚德静, 赵蕾. 与滞留菌形成相关的毒素-抗毒素系统[j]. 辽宁师范大学学报：自然科学版, 2021, 44(2):10.

[2] srivastava a , pati s , kaushik h , et al. toxin-antitoxin systems and their medical applications: current status and future perspective[j]. applied microbiology and biotechnology, 2021.

5. 计划与进度安排

一、查阅文献，写出开题报告（3月6日前完成）

根据论文题目，查阅正式出版的中外学术期刊和专著，从中选择10篇以上参考文献（外文1-2篇或以上），认真阅读，深刻理解，综合分析，掌握其最新动态，参照论文设计任务书的研究内容，写出开题报告。如参考文献要列出作者姓名、论文标题、发表刊物、时间、卷（期）及起止页码。在查阅的文献中选1篇外文（文献内容要结合本研究内容）全文翻译为中文。

二、实验研究前期准备工作（3月20日前）