猪链球菌的耐药性调查及耐药基因检测开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

1.本课题的意义：

猪链球菌病在全世界范围内广泛分布，该病最早报道于荷兰和英国，此后其他养猪业发达国家都有发生。早在20世纪50-60年代，猪链球菌病在我国猪群中就有发生。1998年，在江苏爆发的由猪链球菌2型引致的猪链球菌病,造成大量猪死亡和相关从业人员感染发病。2005年，四川又爆发相似的猪链球菌病疫病^[1]。目前国内对猪链球菌病的预防没有足够的重视，简单地认为使用抗生素治疗就能解决猪链球菌病的问题。但在养殖过程中，将抗生素作为饲料添加剂用于促进动物生长和预防细菌性疾病的发生以及不合理的滥用抗生素，导致猪链球菌对大部分临床应用的抗生素都产生了不同程度的耐药性^[2]。所以定期监测猪链球菌的耐药性变化可以在预防保健过程中根据猪场用药背景进行合理选择和轮换用药。

2.国内外研究概况：

2. 研究的基本内容和问题

1.研究目标： 对本实验室从江苏省、江西省、浙江省和福建省采集的病猪组织及内脏样品中进行猪链球菌的分离鉴定。

使用clsi(美国临床和实验室标准协会)推荐的两倍法肉汤稀释法测试了青霉素、阿莫西林、头孢噻呋、利福平、万古霉素、利奈唑胺、恩诺沙星、麻保沙星、氯霉素、氟苯尼考、林可霉素、克林霉素、泰妙菌素、沃尼妙林、庆大霉素、壮观霉素、替米考星、泰拉菌素、红霉素和多西环素等20种临床常用抗菌药对分离株的mic(最低抑菌浓度)，并分析不同抗菌药的耐药率以及多重耐药的情况以了解发病猪场猪链球菌的耐药现状并。

检测大环内酯类耐药基因erma、ermc、ermb、mrsd，四环素类耐药基因tetl、tetm、teto，恶唑烷酮类耐药基因cfr、optra，截短侧耳素类耐药基因lsa(e)，统计不同耐药基因的检出率，分析耐药表型与耐药基因的关系，为猪链球菌的预防和临床用药提供参考。

3. 研究的方法与方案

1.研究方法及实验方案：

1.1 猪链球菌的分离

分离内脏细菌时，在超净台内用点燃的酒精棉球消毒病料表面，用无菌手术刀切口，接着用经火焰灭菌并冷却的接种环蘸取病料内部组织后无菌划线接种于THB平板上，置于37℃恒温培养箱内培养24 h；分离关节液和血液中细菌时，在超净台内取下注射器针头和针帽，用酒精灯灼烧装有关节液或血液的注射器乳头部灭菌后，THB琼脂平板上推注3-5滴关节液或血液，用灼烧灭菌并冷却的涂布棒涂布均匀，置于37℃恒温培养箱内培养24 h。如果菌落生长缓慢，可延长培养至48 h，使之形成单个肉眼可见菌落，以供鉴定用。

1.2 猪链球菌的鉴定

猪链球菌在37℃恒温培养箱培养24 h后，在THB平板上形成圆形、微凸、表面光滑、湿润、边缘整齐、半透明的菌落，菌落直径为0.3-1 mm。挑取疑似菌落制备细菌涂片，革兰氏染色，镜检。本菌为革兰阳性球菌，菌体直径约1μm，固体培养物以双球菌为多，少量呈3-5个排列的短链，液体培养物以链状为主，无芽孢，能形成荚膜。菌落生长特征、革兰氏染色菌体形态符合者，可初步确定为猪链球菌。将疑似菌落进行再次划板纯化，每块平板上挑取3-5个单菌落接种到THB液体培养基中，培养至对数期后提取DNA进行PCR检测，鉴定猪链球菌引物是gdh（见表1）。

表1 猪链球菌鉴定引物

1.3药敏试验

本研究中采用肉汤稀释法测定MIC，首先在超净台内取猪链球菌冻存液20 μL加入1 mLTSB液体培养基，37℃下180 rpm摇床振摇培养3-3.5 h；利用紫外分光光度仪测定菌液的OD值，在超净台内用TSB液体培养基调整菌液浓度使其OD₆₀₀值=0.1，此时菌液浓度约10⁸ cfu/mL，在此基础上再稀释1000倍，此时菌液浓度约10⁵ cfu/mL，无菌96孔板第1列加入制备好的细菌悬液180 μL；无菌96孔板第2-11列加入制备好的细菌悬液100 μL，最后一列加入空白培养基100 μL作为阴性对照，无菌96孔板的第一列加入药物20 μL，每孔液体终体积是200 μL,每种药重复一次，无菌96孔板的第1-10列进行倍比稀释，废液弃去，第11列不作处理作为阳性对照；药物和菌液上样完毕后，盖好板盖，置37℃温箱培养18-22小时观察结果（结果的判读参照CLSI抗菌药物敏感性试验解释标准）。

1.4 耐药基因的检测

水煮法粗提DNA作为模板，PCR检测ermA、ermC、ermB、mrsD、tetL、tetM、tetO、cfr、optrA和lsa(E)等耐药基因。本实验使用的2×Taq PCR Master Mix推荐体系：上游引物1 μL；下游引物1 μL；2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL；模板2 μL；无菌三蒸水8.5 μL。反应程序：94℃ 10 min(预变性)；94℃ 30s(变性)；Tm-2℃ 30s(退火)；72℃ 10s/1000 bp(延伸)；72℃ 10min(终止)。

反应结束后，取8 μL的PCR产物加入1.5%的琼脂糖凝胶，2000 bp DNA marker作为产物大小参考标准。120V电压，1×TAE缓冲液中电泳20min，取出电泳胶，在凝胶成像系统中观察电泳结果并拍照记录。

2.技术路线：

3.可行性分析：

（1）立论有据，方案可行

本实验对样品中的猪链球菌进行分离鉴定后，通过测定MIC值分析耐药性，PCR检测相关耐药基因，综合分析各地猪链球菌的耐药性情况以及与耐药基因之间的关系，为临床用药及猪链球菌病的预防提供参考。实验思路正确，具有逻辑性与可操作性。

（2）经验丰富，技术成熟

本实验室长期从事大量细菌耐药性相关试验和研究，具有丰富的经验。细菌的药敏实验即MIC值测定以及PCR检测耐药基因的技术成熟，为实验数据的有效性和可靠性提供了保障。

4. 研究创新点

（1）从多种组织中分离猪链球菌，探究了疑似发病猪不同组织内猪链球菌的分布情况。

（2）测定的抗生素种类较全，既包括兽医常用抗生素，也包括人常用抗生素，全面了解目前猪链球菌对各类抗生素的敏感性。

5. 研究计划与进展

（1）2018.9-2018.10

对采集的样品进行猪链球菌的分离鉴定以及纯化。

（2）2018.10-2018.12