影响PEDV复制的宿主蛋白的筛选开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

课题意义： pedv 是威胁养猪业的重要病原之一，对 pedv 复制相关的研究能够使我们对 pedv 感染复制途径有更加深入的了解。利用基因干扰技术与设计好的小干扰rna，我们能够通过转染实验与荧光定量pcr技术，初步验证pedv感染受到小干扰rna干扰后的细胞后复制受到影响，为进一步筛选宿主蛋白，研究pedv复制机理的研究提供理论基础研究背景，应用前景： 干扰rna（rna interference，rnai）导致的基因沉默首先在线虫中通过一个长双链小干扰rna（smallinterferingrna，sirna）的应答被发现，之后被扩展到植物、果蝇和真菌中。在哺乳动物细胞中，长双链sirna 可激活抗病毒防御和基因沉默。sirna是双链rna分子在细胞质中经过处理形成短的、统一的rna片段，长21-25nt，通过rnase-Ⅲ酶裂解而产生的。将rna片段并入到rna－诱导沉默复合体，且选择rna双链中的一条进行重组，导致mrna的降解，sirna可以针对性地限制特定基因的表达，从而毁灭 rnai通路。sirna是srna的第二个分类，生成长双链rna（dsrna），由rna依赖的rna聚合酶的激活生成。基因干扰技术，通过运载sirna到哺乳动物细胞中进行选择性的沉默基因表达和抑制蛋白翻译，成为一种很有前途的精确治疗人类疾病的方法，包括癌症、代谢病、神经退行性疾病和传染性疾病，本实验中用于干扰对应蛋白的合成，验证其对pedv复制的影响。主要参考文献：[1] 李天芝，于新友，梅建国，等 . 猪流行性腹泻病毒分子生物学检测方法研究进展 [j]. 养猪，2016(5) ：81-84.[2]苏运芳，孙彦刚，刘运超，等 . 猪流行性腹泻疫苗研究进展 [j]. 畜牧与兽医，2016，48(2) ：134-138.[3]覃力巾，慕家明 . 猪流行性腹泻的诊疗与防治 [j]. 乡村科技，2016(21) ：21.[4]王隆柏，王晨燕，陈秋勇，等.猪流行性腹泻的诊治及其 2015—2016 年在福建省的流行情况 [j].养猪，2017(4)：126-128.[5]胡鸿惠，南文金，龚中贵，等 . 猪流行性腹泻弱毒疫苗研究进展 [j]. 安徽农业科学，2016，44(26) ：69-72.[6]孙杰龙，熊喜华，汤海林，等 . 规模猪场预防和控制猪流行性腹泻的经验 [j]. 猪业科学，2017，34(3) ：79-80.[7]刘孟洲，王玉安，包高良，等 . 一起因饲喂污染饲料引发猪流行性腹泻传播的典型案例 [j]. 养猪，2017(4) ：111-112.[8]郝建伟，张祥斌，薛春宜，等 . 猪流行性腹泻防控研究概况 [j]. 动物医学进展，2016，37(12) ：100-105.[9]徐仲凯，徐新昌 . 我国猪病毒性腹泻病的流行现状与防控措施 [j]. 中国动物保健，2014，16(5) ：44-46.

[10]王靓靓，张艳，白会新. 猪流行性腹泻病毒的特性研究 [j]. 猪业科学，2016，33(6) ：100-102.

2. 研究的基本内容和问题

研究目标： 初步验证几种小干扰rna对应蛋白的缺失对pedv复制的影响，为日后研究其具体的机制作铺垫。内容： 利用基因干扰技术，通过运载几种特异性的sirna到哺乳动物细胞中进行选择性的沉默基因和抑制蛋白翻译，westblot验证对应蛋白内源性表达降低后，运用荧光定量技术证实了病毒复制受到干扰。拟解决问题: sirna的选择及其筛选有着多种不确定性的问题，如影响复制效果不明显，实验结果重复性较差等问题。

3. 研究的方法与方案

研究方法与试验方案： 1.利用提供的三种待筛选siRNA，分别转染到Vero细胞内，并于24h之后进行接毒（PEDV），接毒后24h内观察到细胞病变后进行收毒，提取RNA，进行反转录，最后利用荧光定量PCR验证小干扰RNA干扰细胞后，对应的蛋白内源性表达降低对PEDV的复制造成了影响。 2.重复试验得到重复性一致的结果之后，筛选出对病毒蛋白复制有显著抑制或促进作用的siRNA再次进行细胞转染，48h之后收蛋白，利用western-blot验证siRNA干扰的蛋白内源性表达降低。 3.筛选出的SIRNA进行转染实验，转染48h后接毒，分别设置2h，12h，24h进行收毒，提取RNA反转录后进行荧光定量PCR，检测SIRNA是与病毒蛋白复制的哪个阶段对病毒复制造成影响。技术路线： 细胞培养-----siRNA筛选与验证（分为蛋白和RNA验证）-----荧光定量PCR可行性分析： 细胞转染实验，荧光定量PCR与Western-bolt都是研究完善的成熟技术，而vero细胞对转染实验的适应性较好，生长较快，适合本实验。

较好，生长较快，适合本实验。

4. 研究创新点

特色：运用siRNA干扰PEDV病毒的复制寻找对应的宿主蛋白创新：对PEDVＮ蛋白核仁定位的分子机制及核仁或某些核仁蛋白在PEDV复制过程中的作用起启示作用

5. 研究计划与进展

研究计划：2018.9-11：利用转染实验筛选对病毒复制有明显作用的sirna，并证明其重复性2018.12-2019.4：验证干扰作用，筛选出对病毒复制有影响的宿主蛋白