雏鸭肝炎病毒的临床分离株的分类和进化分析开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

鸭病毒性肝炎(duck viral hepatitis，dvh) 是由鸭肝炎病毒(duck hepatitis virus，dhv) 引起雏鸭的一种高度致死性传染病。临床上具有明显神经症状和肝脏肿大、表面呈斑点样出血为特征。其主要侵害6 周龄以内雏鸭， 尤以2 日至3 周的雏鸭最为易感，成年鸭有抵抗力。感染不同类型病毒性肝炎和不同日龄的雏鸭发病后死亡率有所不同，有的高达95%，有的低于15%。随着近几年中国养鸭业快速发展， 该病已成为危害中国养鸭业最为严重的疫病之一， 给养鸭业带来了巨大的经济损失。

鸭肝炎病毒（duck hepatitis virus，dhv）包含小核糖核酸病毒科、星状病毒科、嗜肝病毒科3 个病毒科的4 种病毒。嗜肝病毒科的鸭肝炎病毒引起鸭乙型肝炎， 但该病毒对各年龄段鸭没有显著的致病性，临床危害不显著，不在本研究的重点关注范围；小核糖核酸病毒科引起血清Ⅰ型鸭肝炎，星状病毒科引起血清Ⅱ型、Ⅲ型鸭肝炎。Ⅰ 型鸭肝炎病毒(duck hepatitis virus type 1，dhv-1)于1945 年在美国被levine 等首次发现， 可惜由于当时的条件限制未能分离出病毒， 直到1950 年， 美国人levine 和fabricant 从鸡胚中首次分离到病原， 该病原体就是后来的i 型鸭肝炎病毒(duck hepatitis virus type 1，dhv-1)。1965 年在英格兰的诺福克（norfolk） 发生了与Ⅰ 型鸭肝炎病毒(duck hepatitis virus type 1，dhv-1) 病理性质相似的病例， 但发病鸭群已经免疫过Ⅰ型dhv 弱毒株，雏鸭交叉免疫保护试验证明，所分离出的病原与Ⅰ型dhv 不同， 故被命名为Ⅱ型dhv （后来被命名为dastv-1）；toth 在纽约长岛发现了一种可以引起对Ⅰ 型dhv 有免疫力的雏鸭发病和死亡的病毒，但不如Ⅰ型dhv 感染严重。由于该病毒与Ⅰ 型和Ⅱ 型dhv 不同， 被命名为Ⅲ 型dhv（后来被命名为dastv-2）。dhv-1呈世界性分布，也是我国最为常见的鸭肝炎病毒；在1998~1999 年，我国首次发现有Ⅲ型dhv 的存在；近年来也有Ⅱ 型dhv的分离报道。Ⅲ型鸭肝炎病毒一般只感染雏鸭，其不如Ⅰ型鸭肝炎病毒感染严重，雏鸭的死亡率很少超过30%。

本实验室在10多年的临床鸭肝炎病毒分离过程中，有的毒株为dhav-a、有的毒株为dhav-c。没有对病料和鸭胚尿囊液进行dhav-b、dhv-Ⅰi和dhv-Ⅰii的检测。因而本研究拟建立检测dhv-Ⅰ（dhav- a、b和c）、dhv-Ⅰi和dhv-Ⅰii的rt-pcr检测方法，对样品逐一检测。然后对阳性样品扩增的序列进行比对，判断其为与哪个毒株的同源性高并对其生物学特性进行研究。

2. 研究的基本内容和问题

研究近十年来实验室分离出的毒株之间的差异性与共同性，对于研究该病原的进化趋势是有着一定的积极意义的。为今后的的鸭肝炎疫苗的研制提供一些参考。本实验室在10多年的临床鸭肝炎病毒分离过程中，有的分离株为DHAV-A、有的分离株为DHAV-C。但没有对病料和鸭胚尿囊液进行DHAV-B、DHV-II和DHV-III的检测。这也正是本研究的创新之处或价值意义所在。鉴于上述目的，本研究首先建立检测DHV-I（DHAV- A、B和C）、DHV-II和DHV-III的RT-PCR检测方法，对样品逐一检测。然后再选取其中的1-2个毒株进行全基因测序和生物学特性探究。

本研究先要建立一种快速且精准的RT-PCR方法，用来对本实验室近十年来收集的病料及尿囊液进行筛检，检测样品中是否含有DHV-I（DHAV- A、B和C）、DHV-II和DHV-III。然后对筛检结果为阳性的样品抽取几个，将其PCR产物送检测序，将测序结果与从NCBI上搜集的目的基因进行序列比对，查看扩增出的序列是否为目的片段。当扩增片段与目的基因片段相符合时，则说明了建立的RT-PCR方法是可信的。在证明RT-PCR方法的精准性后，将所有的阳性样品做RT-PCR，将产物送检测序。将样品测序结果在NCBI上blast，查看其同源性最高的毒株。然后再与目的基因比对，查看其碱基序列是否有较大的变异。在比对完碱基序列后则进一步比对氨基酸序列。在这一步骤结束后，将阳性样品离心并用滤器过滤，除去细菌，接种12日龄的SPF鸭胚扩毒，收集尿囊液。用鸡胚成纤维细胞检测病毒滴度，对于病毒滴度较高的毒株进行进一步的研究，测试其能否作为疫苗效价评定的标准样。

3. 研究的方法与方案

设计引物

↓

建立rt-pcr体系

4. 研究创新点

研究近十年来实验室分离出的毒株之间的差异性与共同性，对于研究该病原的进化趋势是有着一定的积极意义的。为今后的的鸭肝炎疫苗的研制提供一些参考。本实验室在10多年的临床鸭肝炎病毒分离过程中，有的分离株为DHAV-A、有的分离株为DHAV-C。但没有对病料和鸭胚尿囊液进行DHAV-B、DHV-II和DHV-III的检测。对于病毒滴度较高的毒株进行进一步的研究看是否可以作为疫苗效价测定的标准样。

5. 研究计划与进展

先查阅文献，阅读关于dhv-i（dhav- a、b和c）、dhv-ii、dhv-iii的rt-pcr检测方法的报道。思考建立一个怎样的rt-pcr体系来检测样品，是多重pcr还是多次检测。建立好rt-pcr体系体系后，对实验室近十年来收集的病料和尿囊液进行检测，对检测出的阳性样品，然后对筛检结果为阳性的样品抽取几个，将其pcr产物送检测序，将测序结果与从ncbi上搜集的目的基因进行序列比对，查看扩增出的序列是否为目的片段。当扩增片段与目的基因片段相符合时，则说明了建立的rt-pcr方法是可信的。在证明rt-pcr方法的精准性后，将所有的阳性样品做rt-pcr，将产物送检测序。将样品测序结果在ncbi上blast，查看其同源性最高的毒株。然后再与目的基因比对，查看其碱基序列是否有较大的变异。在比对完碱基序列后则进一步比对氨基酸序列。在这一步骤结束后，将阳性样品离心并用滤器过滤，除去细菌，接种12日龄的spf鸭胚扩毒，收集尿囊液。用鸡胚成纤维细胞检测病毒滴度，对于病毒滴度较高的毒株进行进一步的研究。