JEV入侵宿主细胞3D4/21的分子机制研究开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

日本乙型脑炎（je）是由日本乙型脑炎病毒（jev）引起的，由蚊子传播的人畜共患传染病。jev是黄病毒科，黄病毒属的成员，在亚洲的热带和亚热带地区流行最广，可以导致人类的死亡率接近25%^[1-2]。众所周知，猪是jev的主要扩增宿主，防控猪感染jev以及对猪感染后的治疗措施，是控制jev在人类中的流行和养殖业生产中最重要的一个环节^[3]。jev基因组约11kb，是单链正义rna，编码一个大的多聚蛋白前体，通过被宿主和病毒编码的蛋白酶切割成7种非结构蛋白和3种结构蛋白（c、prm、e）。糖蛋白e是黄病毒的主要抗原决定簇，并在病毒入侵过程中发挥作用^[4-5]。病毒内化后，黄病毒首先被转运至内体中，依赖低ph环境诱导病毒脱壳和衣壳解体过程^[6]。

囊泡的内吞转运途径受rab蛋白调节，rab蛋白是ras超家族的小gtp酶和效应子。rab蛋白参与了囊泡的形成，出芽，靶向运输和融合过程^[7]。其中，rab5参与调节内吞囊泡从质膜转运至早期内体，rab7调节运输晚期内体的运输并转运至溶酶体，rab9也参与了晚期内体的运输，并将晚期内体转运至反式高尔基体网络中^[8]，rab11参与了内体的循环运输过程和囊泡的回收过程。多项研究报道，rab蛋白参与多种黄病毒的生命周期过程，如猪瘟病毒，丙型肝炎病毒，登革热病毒和西尼罗河病毒等^[9]。但迄今为止，仅有一项研究发现早期内体rab5参与jev的入侵过程，而是否存在其它的rab蛋白参与jev感染过程尚不清楚^[10]。

因此，对于rab蛋白调控囊泡运输jev的分子机制研究，可以使我们更好地理解、认识病毒的致病性，对于揭示病毒的致病过程至关重要。

2. 研究的基本内容和问题

本试验设计通过RNA干扰技术、显性负突变体技术和共定位现象等一系列方法，揭示JEV入侵宿主3D4/21的分子机制。

从而为JEV感染分子模型的建立奠定基础，也为抗病毒疗法的开发提供了新的方向，为预防、控制和消灭JEV提供新的依据。

3. 研究的方法与方案

一、研究方法及实验方案

1.1 干扰rab蛋白对jev感染的影响

（1）将3d4/21细胞均匀铺于6孔板中，置于37℃ 5% co₂温箱中培养，待细胞生长至80%左右时进行实验。

（2）使用双无dmem培养基洗3次，用脂质体lipofectamine 3000分别转染sirna（sirab5、sirab7、sirab9、sirab11和sictrl）于6孔板中，具体步骤及sirna的转染剂量按说明书操作。

（3）使用含2% fbs的dmem培养基于37℃ 5% co₂温箱中维持培养36 h，用双无dmem培养基洗3次。

4. 研究创新点

本研究选取的是猪肺泡巨噬细胞（PAM），它是机体重要的免疫细胞,在抵抗病原入侵和免疫应答方面发挥着重要的作用，而3D4/21是猪肺泡巨噬细胞的体外传代细胞系，在体外虽已丧失了吞噬功能，但仍保留细胞因子分泌的功能。

通过研究Rab蛋白对于JEV入侵3D4/21细胞的作用机制，更加有利于我们了解病毒的致病性，对于揭示病毒的致病过程至关重要。

5. 研究计划与进展

2018年9月-2018年11月：完成干扰rab蛋白对jev感染影响的初步研究，主要包括转染、wb、rt-qpcr等操作；

2018年12月-2019年1月：完成confocal观察过表达rab蛋白的wt与dn对jev增殖的影响研究；

2019年2月-2019年3月：confocal观察内源性rab蛋白与jev的共定位。