大蒜素联合抗生素对猪链球菌和大肠杆菌的联合抗菌活性测定开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

大蒜属于百合科葱属植物蒜的鳞茎，味辣、性温，在我国种植广泛，在人们日常生活中是一种常用的调味品，广泛应用于食品行业[1]。目前，随着对于大蒜及其提取物研究的深入，该类物质也逐渐开始应用于医药和畜禽、水产养殖等行业[2-3]。研究表明，大蒜中所含的抗菌成分大蒜素 (allicin) ，又名大蒜新素，是大蒜的提取液或合成物，主要成分为二烯丙基三硫化物 [4]。大蒜具有多种功能，对不同的病毒、细菌、真菌等病原微生物有很大程度的抑制消灭作用，同时能预防及抑制癌症肿瘤的生长，被广泛地称为“天然抗生素”[5-7]，且该类物质无药物残留，可替代部临床使用的抗生素及合成抗菌药物。本试验通过研究大蒜素对大肠杆菌和猪链球菌的抑菌效果，旨在为兽医临床合理使用大蒜素防治细菌感染性疾病提供参考。

[1]宋彦显,闵玉涛.大蒜抑菌作用研究进展[j].中国调味品,2013,38(1),10- 17.

[2]徐小江,肖文军,陈庆,等.大蒜素的抗菌作用[j].医药导报,2010,29（8）,1048- 1051.

2. 研究的基本内容和问题

本实验设计拟探讨研究大蒜素与常用抗生素等的协同抗菌组合联用对大肠杆菌和猪链球菌的抑菌效果，测定大蒜素对大肠杆菌和猪链球菌的最小抑菌浓度，以及大蒜素联合其他抗生素对大肠杆菌和猪链球菌的fic值。

1.2研究的内容

1.2.1菌株的获得

3. 研究的方法与方案

1.1研究方法

1.1.1菌株的获得

1.1.1.1菌株的复苏

将冻存于-20 ℃冰箱的菌液以1:100接种至于培养基（大肠杆菌接至LB培养基，猪练球菌接至含5% 胎牛血清的THB培养基）中，于恒温摇床中 (180 r·min-1，37.0 ℃)振荡复苏12 h。

1.1.1.2菌株的冻存

将已长到对数期的菌液，以菌液:60%甘油为1:1比例接于冻存管中，于-20 ℃冰箱保存。

1.1.2 药物溶液配置

1.1.2.1大蒜素溶液配置

蒜氨酸提取物与蒜酶1:1 (w/w)混合均匀后，加入一定量的水，振荡混匀15 min，即可(如：1 g蒜氨酸提取物与1 g蒜酶， 加水100 mL，浓度以蒜氨酸计为4. 74 mg/mL，以大蒜辣素计为2.18 mg/mL)。溶液应现配现用，6 h内使用有效。

1.1.2.2抗生素的配置

①取10 ml EP管,称取所需浓度的药量(天平上操作)。

②在超净台中加入三蒸水5 mL于①中EP管中，涡旋，使其溶解。

③将该EP管中的液体移入10 mL容量瓶中。

④用1 mL三蒸水将③中EP管洗一次，将洗液移入③中容量瓶内。重复3次,最后留1 mL定容。

⑤配置好的抗生素，可放置-20 ℃保存。

1.1.3最小抑菌浓度的测定

1.1.3.1菌液稀释

① 在超净台内菌保存液10 μL加入1 mL液体培养基（大肠杆菌接至LB培养基，猪链球菌接至含5% 胎牛血清的THB培养基），37 ℃下 180 rpm摇床振摇培养3-3.5 h；

②OD600值测定：利用紫外分光光度仪测定菌液的OD值，在超净台内用含5%血清的MH液体培养基（测定大肠杆菌时，MH液体培养基不加血清）调整菌液浓度使其OD600值=0.1，此时菌液浓度约10⁸ cfu/mL（大约需将培养菌液稀释7-10倍左右），注意无菌操作；

③上样菌液稀释：在超净台内将待测菌液在步骤②所得稀释倍数的基础上再稀释1000倍，此时菌液浓度约10⁵ cfu/mL，此时的菌液即为上样菌悬液；

1.1.3.2药敏试验

将待测抗菌药物进行10倍稀释；

①无菌96孔板第1列加入制备好的细菌悬液180 μL；

②无菌96孔板第2-11列加入制备好的细菌悬液100 μL，最后一列加入空白培养基100 μL作为阴性对照；

③无菌96孔板的第一列加入药物20 μL，每孔液体终体积是200 μL,每种药重复一次，每个板子测4种药；

④无菌96孔板的第1-10进行倍比稀释，废液弃去，第11列不作处理作为阳性对照；

⑤药物和菌液上样完毕后，盖好板盖，置37℃温箱培养18-22小时观察结果（结果的判读请参照附件CLSI抗菌药物敏感性试验解释标准）。

严格注意无菌操作。

1.1.4联合抑菌试验

1.1.4.1药液的稀释

将抗生素A和大蒜素的浓度稀释为4MIC、2MIC、MIC、0. 5MIC、0. 25MIC、0. 125MIC、0.063MIC μg /mL。

1.1.4.2棋盘法测联合抑菌

①A 排前6孔加4 MIC抗生素A每孔50 μL,第7孔加2 MIC抗生素A 100 μL；

②B 排前6孔加2 MIC抗生素A每孔50 μL,第7孔加1 MIC抗生素A 100 μL；

③C 排前6孔加1 MIC抗生素A每孔50 μL,第7孔加0.5 MIC抗生素A 100 μL；

④D 排前6孔加0.5 MIC抗生素A每孔50 μL,第7孔加0. 25 MIC抗生素A 100 μL；

⑤E 排前6孔加0.25 MIC抗生素A每孔50 μL,第7孔加0.125 MIC抗生素A 100 μL；

⑥F 排前6孔加0.125 MIC抗生素A每孔50 μL,第7孔加0.063 MIC抗生素A 100 μL；

⑦第1 列前6 孔加4 MIC大蒜素每孔50 μL, 第7孔加2 MIC大蒜素100 μL；

⑧第2 列前6 孔加2 MIC大蒜素每孔50 μL, 第7孔加1 MIC大蒜素100 μL；

⑨第3 列前6 孔加1 MIC大蒜素每孔50 μL, 第7孔加0.5 MIC大蒜素100 μL；

⑩第4 列前6 孔加0.5 MIC大蒜素每孔50 μL, 第7孔加0.25 MIC大蒜素100 μL；

第5 列前6 孔加0.25 MIC大蒜素每孔50 μL, 第7孔加0.125 MIC大蒜素100 μL；

第6 列前6 孔加0.125 MIC大蒜素每孔50 μL, 第7孔加0.063 MIC大蒜素100 μL；

A-F前7孔, 每孔加稀释菌液100 μL, 其中F7孔作为生长对照，F8加MH培养基作为阴性对照。

1.1.4.3联合药敏试验结果判断

联合药敏试验的结果有四种类型：

协同作用：两种抗菌药物的联合活性明显大于各个单药抗菌作用之和(1 1 2)。

累加作用：两种抗菌药物联合以后其活性较任一种单药稍有增加(1 1 =2)。

无关作用：两种抗菌药物的活性均不受另一个药物的影响(1 1 =1)。

拮抗作用：一种抗菌药物的活性被另一种药物消弱(1 1 1)。

在实验室中以部分抑菌浓度的计算作为联合药敏试验的判断依据。

FIC 指数=甲药联合时的MIC/甲药单独时的MIC 乙药联合时的MIC/乙药单独时的MIC

指数≤0. 5协同作用；0. 5-1相加(累加)作用；1-2无关作用；2拮抗作用

1.2技术路线

1.3实验方案及可行性分析

1.3.1实验所需菌株充足

本课题研究需要大量菌株。本实验室前期对疑似病料的检验检测工作中，保藏足够本实验项目开展所需数量的菌株，因此能够顺利开展实验。

1.3.2可行性分析

学生在本科前四年期间通过向师兄师姐学习，顺利完成SRT与SPT研究项目，能大部分掌握研究所需的各项实验技能，且能够熟练检索文献、总结归纳现有的研究成果，相信通过自身的努力一定能够圆满地完成本项目。

4. 研究创新点

大蒜素是一种安全无公害化的天然抗生素，与抗生素类促生长剂的作用效果相似，且易得、结构简单。

生物活性明显、治疗范围广泛、副作用小、无致突变、致畸、致癌性等问题，是一种较为安全有效的抗菌、保健、促生长类添加剂。

本试验采取棋盘法测定大蒜素与一些常用抗生素的联合抑菌，通过体外药物试验，确定大蒜素与一些常用抗生素之间是否能产生协同或相加作用，从而为兽医临床抗生素的替代品的选择提供参考。

5. 研究计划与进展

第一阶段：获得并冻存菌株

第二阶段：大蒜素以及常用抗生素对大肠杆菌和猪链球菌的最小抑菌浓度（mic值）的测定

第三阶段：棋盘法测定大蒜素联合其他抗生素对大肠杆菌和猪链球菌的fic值