猪肺炎支原体NADH氧化酶的原核表达及多抗制备开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

猪支原体肺炎（mycoplasmal pneumonia of swine,mps）又称为猪地方流行性肺炎（swine enzootic pneumonia）,俗称猪气喘病或喘气病。是由猪肺炎支原体（mycoplasma hyopneumoniae，mhp）引起猪的一种慢性呼吸道传染病，主要临床症状为咳嗽和气喘，病理变化特征是肺的尖叶、心叶、中间叶和膈叶前缘呈虾肉样变^[1]。患猪长期生长发育不良，饲料转化率低，经继发性感染导致死亡,严重危害养猪业的发展。猪肺炎支原体是没有细胞壁的原核细胞型微生物，体积微小，革兰染色呈阴性，但着色较差，吉姆萨或瑞氏染色效果较好^[1]。猪肺炎支原体对培养基的营养条件要求非常苛刻，在一般的培养基中很难生长。病猪和带菌猪是本病的传染源。本病既可通过健康猪与感染猪接触传播，也可通过空气传播^[2]，在老疫区、患病母猪是主要传染源,母猪将病原体传给仔猪,造成猪肺炎支原体在这些猪群长期的存在,因而所生仔猪易患支原体肺炎。症状消失但未完全康复的猪或用药物治疗但未完全治愈的猪体内仍然带菌,仍可传播本病^[2]。综上所述，本病传播能力强，致病力强，完全治愈较为困难，给养猪业带来巨大的伤害。

还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide,nadh）存在于各种生物体中，在各种代谢反应中起氧化还原的作用，是一种辅助因子。由nox基因编码的nadh氧化酶（nadh oxidase，nox）是一种氧化还原酶，首先发现于人体中性粒细胞和巨噬细胞^[3]，近年来研究发现，nox基因也存在于一些细菌中，编码nadh氧化酶，对细菌有重要的作用^[4]。国内外越来越多的研究表明，nadh氧化酶与病原菌等的毒力相关。1999年，有国外学者对肺炎链球菌（streptococcus. pneumoniae）nadh氧化酶进行研究，首次发现其酶活性降低会导致病原微生物的适应力及毒力降低^[5]，已有学者证实了nox基因确实参与血链球菌(streptococcus sanguinis)中的生物膜形成^[6]。zhao 等最近证实肉牛传染性牛支原体的 nadh 氧化酶既是一个 nadh 氧化和氧气还原酶，又是一个粘附素^[7]。因此，对 nadh氧化酶和nadh黄素氧化还原酶作用机制的研究有利于指导临床微生物感染的防治及临床新药物的研发。

参考文献：见附件。

2. 研究的基本内容和问题

1. 研究目标：

   纯化出高浓度的蛋白以便进行油佐剂免疫抗原的制备，将制备好的油佐剂免疫抗原对新西兰大白兔进行免疫，获得兔抗猪肺炎支原体nadh oxidase高免血清，并进行蛋白功能鉴定。

2. 研究内容：

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   3. 研究的方法与方案

   1. 研究方法：分子生物学实验法、动物实验法、文献研究。

   2. 技术路线：蛋白的大量表达（原核表达）→sds-page检测分析→目的蛋白的纯化→超滤浓缩并检测浓度→油佐剂免疫抗原制备→免疫→制备高免血清→elisa检测抗体效价→western blot检测抗体特异性→除菌分装、冻存

   3. 实验方案：（1）蛋白的大量表达：前期已将目的基因nox连接于pet-32a表达载体。将表达菌1株单克隆菌落接种于100ml的lb培养基 (含有50ul的amp抗生素)中,37℃培养过夜；按照1:100的比例转接过夜培养的bl21 (de3) 到2 l新鲜的含amp的lb培养基，37℃180 rpm摇菌培养3.5 h，加入终浓度为 1 mm 的iptg，继续37 ℃ 180 rpm摇菌培养5 h；4℃12000 rpm离心15min收集细菌后，加入20 ml 1×pbs重悬菌体，再次离心，清洗菌体。（2）sds-page检测分析：将样品混合上样缓冲液，煮沸10min，进行sds-page凝胶电泳，设置全菌对照。（3）超声：用基础缓冲液加入pmsf，并对菌体充分匀浆，置冰上进行超声，确保超声完全。（4）蛋白纯化：①上清纯化：用超纯水和基础缓冲液液平衡镍柱后将蛋白上清倒入镍柱进行挂柱，重复挂柱三次。用基础缓冲液洗脱未挂柱的蛋白后，分别用50mm、100mm、250mm咪唑洗脱液洗脱并收集滤液，期间可用蛋白检测液检测，至不变蓝为止。用500mm咪唑洗脱液洗脱后用20％乙醇封柱，4℃保存柱子。sds-page检测目的蛋白的具体洗脱浓度。用超滤管浓缩蛋白液，重复三次后检测蛋白浓度。②包涵体纯化：细菌破碎后的沉淀用包涵体洗涤液重新溶解，离心弃上清；包涵体binding buffer溶解沉淀，离心收集上清；超纯水和包涵体binding buffer平衡柱子后用elution buffer洗脱蛋白样品并收集洗脱液。用20％乙醇封柱，4℃保存柱子。（注意：所用试剂均需用0.45或0.22μm滤膜过滤）（5）透析法复性蛋白（包涵体型）：透析袋使用前放入大量含10mm nahco3和1mm edta(ph 8.0)的溶液中，煮沸30min，用去离子水彻底清洗透析袋，使用前1mm edta溶液中煮沸30min。用移液器将蛋白液移至透析袋中，并用透析夹夹紧。将透析袋依次放入10倍蛋白体积的含4m-2m-1m-0.75m-0m脲的pbs中进行脲梯度透析，放入磁力搅拌器搅拌，每个浓度室温透析4h或4℃透析8h。sds-page检测目的蛋白并超滤浓缩，测蛋白浓度。（注意：所用试剂均需用0.45或0.22μm滤膜过滤）（6）油佐剂免疫抗原制备：将弗氏佐剂倒入乳化容器，10000 r/min搅拌，边搅拌边将抗原以1：1的比例缓慢加入，20000 r/min 乳化1.5-2min。首免选用弗氏完全佐剂免疫原，二免、三免及加强免疫用弗氏不完全佐剂免疫原。（7）免疫：选用两只健康、未感染猪肺炎支原体的新西兰大白兔。iha抗体检测，确定兔子未感染mhp；在0、14、28、35、42日对兔子进行采血与免疫。day 0：1免，弗氏完全佐剂免疫原。day 14：2免，弗氏不完全佐剂免疫原。day 28：3免，弗氏不完全佐剂免疫原。day 35：耳缘静脉采血，elisa检测抗体效价。d42：心脏采血，elisa检测抗体效价，wb检测抗体特异性。

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      4. 研究创新点

      国内外学者们对细菌的nox基因的研究甚少，对nox基因功能的探讨存在很大的争议，对nox基因潜在的作用机制、致病机理并不清楚。前期通过生物信息学对mhp强弱毒力菌株的比对分析发现，nadh氧化酶（nadh oxidase）仅存在于mhp 168中，近来越来越多的研究表明，nadh氧化酶与病原菌等的毒力相关。对 nadh氧化酶和作用机制的研究有利于指导临床微生物感染的防治及临床新药物的研发。

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      5. 研究计划与进展

      （1）2018年10-12月完成原核表达目的蛋白的大量纯化及质量分析。

      （2）2019年2-3月完成高免血清的制备及效价检测，蛋白功能鉴定。

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