1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
本课题通过对南京及周边地区活禽的采样，运用pcr引物鉴定的方法确定其禽流感病毒的亚型，之后对其病毒全基因组进行扩增测序，对病毒绘制进化树进行分析，以关注此类病毒变异情况。加强活禽市场流感病毒的流行变异趋势的监测对流感病毒的综合防控及公共卫生健康具有重大的现实意义。
禽流感是世界各国重点检疫和防范的对象，各国科学家对病毒的来源、抗原变异、耐药位点、毒力位点、受体结合位点、潜在糖基化位点等进行深入分析，对疾病的流行病学包括传染源、传播途径、感染危险因素等也进行了广泛研究。区域性调查结果显示，h9亚型aiv尤其是h9n2亚型aiv与其他类型病毒的重组风险逐渐升高，并且需要关注其对公共卫生安全的潜在威胁。如王海明等从东亚-澳大利亚候鸟迁徙路线上的家禽和候鸟分离的h9n2亚型毒株表现为较高遗传多样性和频繁的基因重组。刘东等对华东地区2013~2015年的h9n2亚型分离株ha基因遗传进化分析显示，62个分离株的ha基因都属于dk/hk/y280/97-like病毒亚系中的h9.4.2.5分支，所有分离株的226位氨基酸均为leu，与人流感病毒一致，表明该地区流行的h9n2亚型毒 株具有与2，6-gal唾液酸受体结合的可能，对哺乳动物的致病可能大大增加。吴南屏等从浙江省活禽交易市场分离到的h9n2亚型aiv遗传进化分析显示，这些分离株与其他亚型病毒发生了重组，并发现了一株由qa/hk/g1/97-like、ck/bj/1/94-like、dk/hk/y439/97-like重组而成的新的h9n2亚型毒株。
通过对病毒的分离和血清学、pcr等方法确定其亚型。相比于 elisa、中和试验、间接免疫荧光法、等血清学和免疫学方法，pcr可以快速有效地检测出禽流感病毒，对 禽流感的亚型鉴定和流行病学调查起到很好的作用，具有很大的应用前景。
2. 研究的基本内容和问题
本次研究的目标是通过对南京市活禽市场进行aiv的分离鉴定及基因组序列的遗传演化分析，掌握活禽市场aiv的流行变异趋势。
本次研究的主要内容有：
1.样品采集：对南京及周边地区多个活禽市场的禽类采集其咽拭子，，样品经双抗处理后进行病毒分离。
3. 研究的方法与方案
1.样品采集：于2018年9月到10月从南京市部分活禽市场采集禽咽喉拭子，采集地包括凤翔、景明佳园等活禽市场，样品经双抗处理后进行病毒分离。
2.病毒分离与鉴定：将采集的样品离心后，取上清液经尿囊腔接种spf鸡胚，置于37℃孵化箱，24h后照胚并收集死亡的鸡胚，48h收集存活鸡胚的尿囊液，参照国标法进行红细胞凝集试验并进行pcr鉴定。将阳性的尿囊液通过有限稀释法接种鸡胚进行纯化，将纯化后的病毒进行分装，冻存于-80℃冰箱。
3.抽提核酸：从-80℃冰箱取出一管收集的血凝阳性尿囊液放置在冰盒中解冻，拿至病毒房中，取200ul尿囊液和20ul蛋白酶k加入到rna抽屉试剂盒的第1和7孔，剩余尿囊液冻于-80℃（注意与未冻融的样品分开存放），用机器提取核酸（具体可参照说明书）；约30min提完后，在rna专用操作台中吸出第6和12孔中的一部分rna进行反转录，剩余的液体全部吸入rnase-free离心管中，编号后-80℃保存。
4. 研究创新点
1.南京市对禽流感的流行病学研究较少，急需掌握活禽市场AIV的流行变异趋势以便对流感病毒进行综合防控，保障公共卫生健康。
2.对病株进行测序分析并绘制其系统进化树可以较清晰的显示其遗传相关性或毒株是否在基因重组现象。
5. 研究计划与进展
病料的采集及保存，查阅相关资料书籍，收集相关资料（9~10月份）
病毒分离与鉴定（11月份）
核酸的提取、病毒亚型鉴定（12~1月份）
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