和缓艾美耳球虫内生性发育和病理变化研究开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

鸡的球虫病是养鸡业中常见的寄生虫疾病，由于鸡球虫分布十分广泛，且所有日龄和品种的健康鸡对球虫均有易感性，在鸡舍环境差、饲养管理不当时球虫病极易发病，并且常能迅速波及全群，给养鸡产业带来巨大的经济损失。全世界报道的寄生于鸡的艾美耳球虫有九种，但公认的有七种。我国报道的至少有七种艾美耳球虫。其中和缓艾美尔球虫(eimeria mitis tyzzer，1929)在鸡的艾美耳球虫属中属于致病力较弱的一类，单独低剂量感染和缓艾美耳球虫虽不引起明显的肉眼病变，但当鸡大量感染和缓艾美耳球虫时会影响鸡只增重^[1]，降低饲料转化率，出现明显的病理变化, 感染病鸡表现为生长缓慢, 产蛋量下降, 腿、喙部角质鳞片区黄色素减少, 肠表面苍白, 小肠绒毛(特别是小肠后段的肠绒毛)萎缩脱落，肠内容物稀薄,小肠肠壁变薄等^[2]。然而在自然条件下，鸡群往往不会单独感染和缓艾美耳球虫，而是与其它球虫或病原微生物混合感染，从而加剧球虫的致病性^[3]，加重对鸡肠道的损伤甚至引起感染鸡的死亡，这会对养鸡产业造成严重的经济损失。

和缓艾美耳球虫最早是由tyzzer在对一发球虫病的鸡场进行球虫种鉴定时发现的，这种新发现的小卵囊近圆形，且致病性弱一般不会引起感染鸡明显的病理变化^[4]。由于和缓艾美耳球虫致病性较弱且由其导致的病理变化不明显，而受到人们的忽视。直到有关e．mivati(变位艾美耳球虫)有效性的争议才使人们对和缓艾美耳球虫开始加以关注。由于以往鉴定球虫可以通过卵囊的形态特征、寄生部位和病理变化的观察再加上最小潜在期的测定便能准确无误的鉴定，但和缓艾美耳球虫的形态大小与堆形艾美耳球虫相似再加上一般的感染没有明显的特征性病理变化，所以用一般传统的方法鉴定和缓艾美耳球虫是会产生误差的。随后shirley等科学家采用交叉免疫和酶电泳的方法证明来自houghton(英国)、usa和auburm(美国)等三株变位艾美耳球虫实际上是由数量居多的堆形艾美耳球虫和数量较少的和缓艾美耳球虫混合物^[5]。自此以后，与和缓艾美耳球虫相关的研究逐渐多了起来。由于地区不同，不同虫株的形态大小也会略有差异，tyzzer测得的和缓艾美耳球虫孢子化卵囊为16.24μm1.46μm15.51μm1.56μm，形态指数1.05。在中国的一次球虫种类调查中测得一株和缓艾美耳球虫卵囊近圆球形，大小约为15.80μm15.21μm^[6]。然而对和缓艾美耳球虫的具体寄生部位长期以来仍具有争议。有研究发现和缓艾美耳球虫最先坐在小肠的前段寄生^[7]。joyner发现和缓艾美耳球虫的裂殖体和游离裂殖子首先在卵黄蒂之前的肠道内出现，但并不完全局限在这一场段内，虽然主要集中在卵黄蒂之前但有时会在整个肠段也可见到配子体^[8]。根据shirley和jeffers的报道可知他们首先在回肠和盲肠中发现了和缓艾美耳球虫的虫体^[9]。steve则发现从空肠到直肠都可见到虫体，甚至在卵黄囊腔也可发现虫体^[10]。ruff和edgar也发现在整个小肠段都有和缓艾美耳球虫感染，虫体分布于肠绒毛上且肠绒毛的顶端分布最多^[11]。综合来看，和缓艾美耳球虫主要是寄生在回肠、盲肠和直肠，但在其内生发育的早期整个肠道都可能感染，尤其是临近卵黄囊的肠道感染会更严重 ^[12]。在我国，和缓艾美尔球虫分布很广，已有15个省、市发现^[13]。但对其内生性发育史、病理变化、致病性及其他生物学特性的调查研究较为少见。而且由于和缓艾美耳球虫的致病性弱，实验时单独感染该虫的实验鸡虽然平均增重受到严重影响但其肠道病变计分和死亡率均为零 ^[1]。一般的肠道病变评分方法及死亡率评分法对感染和缓艾美耳球虫的病鸡并不适用。且和缓艾美耳球虫常与其他球虫一起混合感染，其他球虫引起的病理变化及病症很容易掩盖由和缓艾美耳球虫引起的细微的肠道病理变化，加大了对和缓艾美耳球虫鉴别诊断的难度。对和缓艾美耳球虫内生性发育及病理变化的研究将对其生物特性及其引起的病理变化做进一步探讨，研究其寄生部位的特异性将会给和缓艾美耳球虫的诊断带来许多方便，并且也是虫种鉴定工作的基础。

参考文献：

2. 研究的基本内容和问题

本次实习的研究目标：探究和缓艾美耳球虫的内生性发育史及其导致的肠道病理变化。

研究内容：通过对实验鸡攻虫后不同时间段各部分肠段的采集、采集肠道的固定、制片、染色观察和肠黏膜压片观察等方式来了解不同时间段和缓艾美耳球虫内生性发育阶段、寄生部位及其导致的鸡肠道内的病理变化。

拟解决的关键问题：饲养实验鸡时保证每组实验鸡不被其他球虫混合感染或交叉感染。空白对照组的鸡自饲养起到全部宰杀完毕都要全程保持干净，不感染球虫。每组实验鸡对应一组剖检的器具，不可混合使用，每次使用完后要对器具进行清洗，以免不同组实验鸡或同组实验鸡不同时间段体内球虫互相混合影响实验结果。

3. 研究的方法与方案

技术路线：对实验鸡进行攻虫→分时间段宰杀攻虫鸡和空白对照组→取肠道观察拍照，采样；刮取肠道黏膜压片观察→样品处理、制片、染色、观察→整理数据、分析。

实验方案：饲养3组实验鸡，每组40只，第一组和第二组实验鸡每只鸡以等量的和缓艾美耳球虫纯孢子化卵囊经口注入，第三组鸡设为空白对准组。第一组的实验鸡分别在经口攻虫后6、12、18、24240小时宰杀一只，将全部肠管取出体外观察拍照，取十二指肠、卵黄蒂前10cm部位的小肠、卵黄蒂后5cm部位的小肠和盲肠在pbs缓冲液中冲洗干净后分别置于10%多聚甲醛小瓶中固定，并做切片、染色后观察。第二组的实验鸡分别在经口攻虫后6、12、18、24240小时宰杀一只，将全部肠管取出体外观察拍照，于第一组攻虫鸡采集肠道的相同部位截取肠道用pbs缓冲液洗净后刮取肠黏膜做压片置显微镜下观察。第三组空白对照鸡分别经口打入相同剂量的生理盐水后6、12、18、24240小时宰杀一只，将全部肠管取出体外观察拍照，取十二指肠、卵黄蒂前10cm部位的小肠、卵黄蒂后5cm部位的小肠和盲肠在pbs缓冲液中冲洗干净后分别置于10%多聚甲醛小瓶中固定。

可行性分析：本次实习需要饲养大量鸡只及每组实验鸡进行解剖、取样、保存、观察等步骤相对应的器材，这些条件是本人所在的南京农业大学寄生虫组实验室都可提供的，实验过程中所需试剂均能购入或由学生本人配制齐全，在硬件配置上该试验可以进行。要保证该实验方法可以顺利实施必须保证实验鸡不受到其他球虫污染干扰，这需要在饲养实验鸡时特别注意饲养器具的清洁及饲料、水源不可受到污染，每次给实验鸡加食水时要佩戴对应的无菌手套，不同组实验鸡准备对应的饲料、水进行饲养不可交叉污染。保证实验鸡不受到其他球虫混合感染及交叉感染时该试验可以进行。

4. 研究创新点

本实验专门针对单独感染和缓艾美耳球虫的鸡进行，不同于以往研究的感染和缓艾美耳球虫对鸡平均增重的影响而是探究和缓艾美耳球虫在进入实验鸡体内后不同时间段的发育变化，及其不同发育阶段所寄生的部位是否有区别。观察实验鸡在感染和缓艾美耳球虫后其肠道在不同时间段的病理变化。

5. 研究计划与进展

（1）2016.9~2016.10：查阅相关文献资料，熟悉毕业设计任务。

（2）2016.10~2016.11：确定毕业论文选题，查阅文献，对开题报告进行撰写及修改，进行实验，收集数据。

（3）2016.11~2016.12：统计分析数据，撰写论文及修改。