山羊副流感病毒3型两种疫苗水佐剂的比较开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

2013年下半年至2014年3月，江苏多地育肥羊出现呼吸道症状为主的疾病。采集不同发病场鼻拭子和血清样品，检测呼吸道相关病原，在大部分样品中检测到副流感病毒3型。将阳性病料接种于 mdbk 细胞，连续传5代，经 rt-pcr和血凝试验检测证实分离到病毒，命名为js2013。扩增完整的 m 基因，进行进化分析表明该毒株不同于牛和人副流感病毒3型，具有独特的基因特征。这是国内外首次报道山羊源副流感病毒3型的分离鉴定。

副黏病毒是引起中枢神经系统和呼吸道疾病的重要病原，副流感病毒3型是其中的重要成员。piv3属于副黏病毒科呼吸道病毒属，是有囊膜的单股负链 rna病毒。该属病毒包括人副流感病毒1型和3型（hpiv1、hpiv3）、牛副流感病毒3型（bpiv3）和仙台病毒。piv3宿主范围很广，已报道在牛、绵羊、山羊、豚鼠、野牛、水牛、犀牛、骆驼等动物存在。piv3感染。bpiv3是引起牛呼吸道疾病的主要病原，对世界养牛业造成巨大的危害。bpiv3引起的临床表现差异较大，可以是无症状的亚临床感染，也可以表现严重的呼吸道疾病。在应激、营养缺乏、天气突变等因素刺激下，bpiv3 感染能造成组织损伤和免疫抑制，引起支气管肺炎和继发感染，造成较高的发病率和死亡率。中国已有牛群中分离到 bpiv3报道，证实国内存在 bpiv3a和 bpiv3c两个基因型，但尚未有羊群中piv3 感染情况及其与 bpiv3 关系的 报道。2013年下半年起江苏多地山羊养殖场育肥山羊陆续出现以呼吸道症状为主的疾病，临床表现等均不同以往。通过实际调查、多次采样，对样品中可能的相关病原进行检测，在多数样品中检出 piv3，由细胞培养分离到病毒，经 rt-pcr和血凝试验证实，进一步对其 m 基因进行测序和进化分析，结果表明毒株与bpiv3和 hpiv3均具有显著差异，在进化上处于独立的分支。这将为后续研究奠定基础。

佐剂作用于半抗原或抗原和参与免疫应答的细胞,主要通过增强巨噬细胞活性,促进t细胞或b细胞的反应来行使其作用。佐剂可突出抗原表位,诱导较强的免疫应答;有的使抗原颗粒化而缓慢释放,诱导长时期的免疫应答。早在1925 年，ra-mon 发现一些与抗原无关的物质如金属盐、皂角甘等可增强类毒素或白喉毒素的免疫效果，免疫佐剂便被广泛地应用于疫苗的生产和研究中。佐剂可非特异性地通过物理或化学的方式与特异性抗原结合，从而诱导机体免疫系统( 体液或细胞免疫系统) 产生对抗原或免疫原的免疫应答反应，包括增强免疫反应强度和反应的持久性。常用的佐剂有铝盐佐剂、矿物油佐剂、表面活性剂类佐剂、天然来源及中草药佐剂、细胞因子佐剂以及纳米佐剂等。

2. 研究的基本内容和问题

研究目标：比较不同佐剂对山羊副流感病毒3型免疫小鼠的体液免疫（血清抗体）、细胞免疫（淋转试验）的影响。

研究内容：

主要研究内容是不同佐剂条件下山羊副流感病毒3型疫苗的制作，以及疫苗接种后免疫小鼠各个阶段的免疫水平。

3. 研究的方法与方案

研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析研究方法：1.1制备病毒抗原复苏于-70℃保存的cpiv-3 js2013株接种于长满单层mdbk细胞瓶中，吸附1h。

加入含有2%血清的dmem营养液，至于37℃，5%co2 的温箱中培养5-7天，观察到明显的cpe后收毒至于-70℃冰箱保存。

1.2 病毒滴度的测定1.2.1 1%豚鼠红细胞悬液的制备采集经抗凝剂处理的豚鼠的血液，用生理盐水洗涤3次，每次均以4000r/min离心5min，洗涤后用生理盐水配成1%（v/v）红细胞悬液，4℃保存备用。

4. 研究创新点

无

5. 研究计划与进展

研究计划及预期进展先期计划先学习细胞与病毒培养与传代技术，同时重温并练习rt-pcr技术、血凝实验。

之后开始进行抗原的制备，病毒的灭活等，然后购买小鼠，制作不同佐剂的疫苗。

小鼠接种制作的疫苗，进行饲养，一周后进行眼球采血，取部分小鼠处死进行淋巴细胞转化实验、以脾细胞及血液测定接种一周小鼠的免疫水平。