荆州黑麦2R染色体标记的筛选与定位开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

黑麦（secale cereale）属于禾本科小麦族小麦亚族（triticinae），染色体数2n=2x=14，染色体组rr，黑麦属异花授粉作物，具有丰富的遗传多样性（侯永翠等, 2001; varshney et al. 2007; 王海娟等, 2008）。目前发掘的黑麦抗性基因涉及多个黑麦品种，包括petkus、insave fa、prolific、rosen、chaupon、德国白等，除上述源自黑麦petkus、insave fa染色体1r上的抗性基因外，研究发现不同黑麦品种的1r染色体携有不同于广泛应用的涉及1rs易位系的抗性基因。李兴锋等（2004）、吴金华等（2009）分别从六倍体小黑麦劲松49和奥地利黑麦的杂交后代中发现1r染色体具有不同于pm8的白粉病抗性，ji et al.（2008）从小偃6号与德国白杂交后代中选育出2个新的t1rs.1bl，对条锈病混合小种的抗性和品质均优于国内推广的含t1rs.1bl品种。杜万里等（2009）对小麦-黑麦双二倍体材料兰小黑和普通小麦杂交后代中抗条锈、白粉病的大穗材料进行鉴定，发现其为t1rs.1bl易位。研究表明，黑麦具有丰富的遗传多样性，进一步发掘和利用不同黑麦品种的抗性基因，以及通过基于标记辅助选择的抗性基因聚合育种可以大大拓宽小麦抗性基因的遗传基础，增加小麦的持久抗性。尽管目前对黑麦基因资源的利用已取得了很大进展，但由于黑麦的异花授粉特性，黑麦属不同物种及栽培黑麦不同地方品种间存在较大的遗传差异，黑麦的遗传多样性为小麦品种改良提供了丰富的基因资源，进一步发掘和利用不同黑麦品种中的优异基因仍具很大潜力。

荆州黑麦（secale cereale cv. jingzhouheimai）是发现于我国湖北省荆州地区襄河两岸沙丘及滩地的一种栽培黑麦类型，不仅抗多种麦类病害、耐瘠薄，而且易于与普通小麦杂交，并已有培育成功小麦品种（系）的报道（蔡习文1994）。通过多年鉴定发现荆州黑麦及本研究所创造的辉县红-荆州黑麦双二倍体高抗小麦白粉病、梭条花叶病等多种病害（亓增军等. 2000），并进一步获得了涉及染色体1r、2r、3r、4r、5r的一批辉县红-荆州黑麦异附加（代换）系（李爱霞 2006; 王丹 2010; 陈婷婷2010）。鉴定表明，荆州黑麦2r染色体上携有抗梭条花叶病基因和抗白粉病基因（李爱霞 2006），其中抗白粉病基因经抗谱分析表明，明显不同于已经报道的位于黑麦rosen染色体2rl上的pm7基因（friebe et al. 1996; jiang et al. 1994），因而该基因初步命名为pmjzhm2rl（zhuang et al. 2011）。这些抗病新基因与现有的抗病基因相结合将有助于提高现有小麦品种抗性的稳定性和持久性。

est (expressed sequence tags) 是长约150~500bp的基因表达序列片段。est 技术是将mrna 反转录成cdna 并克隆到质粒或噬菌体载体构建成cdna 文库后，大规模随机挑选cdna 克隆，对其5或3端进行一步法测序，所获序列与基因数据库中已知序列进行比较，从而获得对生物体生长、发育、代谢、繁殖、衰老死亡等一系列生理生化过程认识的技术。

2. 研究的基本内容和问题

1、研究目标

从小麦第2部分同源群est标记中筛选荆州黑麦多态性标记，并利用一套辉县红-荆州黑麦异染色体系进行染色体定位，筛选2r染色体特异标记。

2、研究内容

3. 研究的方法与方案

DNA提取：黑麦总基因组DNA提取采用SDS法，具体步骤如下：

① 称取2-4 g小麦叶片，放入研钵中，加液氮后充分研磨。

② 转入20 ml(约样品的一倍体积)DNA提取液中，混匀，65 ℃水浴振荡

（301-501 rpm）1 h左右。

③ 取出冷却至室温，加入等体积氯仿/异戊醇（24:1）混合液，充分混匀后，

室温振荡1 h左右使之完全混合。

④ 室温3000 rpm离心30 min。

⑤ 取上清液加入2倍体积预冷的无水乙醇，-20 ℃静置1 h后，使DNA沉淀。

⑥ 钩出DNA，于70%酒精中漂洗2-3次。

⑦ 挑出DNA，用DNA MINI机吹干后，溶于适量TE（pH=8.0）中。

⑧ 取少量DNA原液经适度稀释后用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，与标准浓 度的λ DNA梯度对照比较定量。

附：（1）DNA提取液（1000 ml）

即配即用，充分混匀后调节pH至8.0。

（2）50TE（100 ml）

加水至1000 ml，灭菌。

（3）Tris-HCl (PH=8.0 1 M 1000 ml)

混匀充分浴解后，调整PH至8.0，灭菌。

用SDS方法提取基因组DNA后，加入适量10 mg/ml RNase，置37 ℃ 30 min，降解RNA。再用氯仿-异戊醇(24:1)抽提一次，将DNA沉淀、吸干、溶解、定量。

PCR扩增：PCR扩增及检测

a. PCR反应体系（10 ml ）：

模板基因组DNA 2 ul（25 ng/ml）

SSR Primer(F-R) 0.5 ul（10 uM）

10buffer 1.0 ul

dNTP (2.5mM) 0.8 ul

MgCl₂ (25mM) 0.8 ul

Taqase 0.1 ul (0.5 U)

ddH₂O 4.8 ul

总体积 10 ul

混匀离心后加上一滴石腊油覆盖，防止水份蒸发。

b. PCR扩增条件：

94 ℃

94 ℃ 30 s

52 ℃/ 55 ℃/58 ℃ 50 s

72 ℃ 1 min 20s

72 ℃ 10 min

聚丙烯酰胺凝胶电泳：

a.PCR扩增产物中加入聚丙烯酰胺凝胶电泳专用loading buffer 2 ul，混匀，取3 ul PCR产物用8%聚丙烯酰胺凝胶（39 : 1）电泳检测结果。电泳时总电压为180 V，电泳1.5 h左右。

b.银染检测扩增产物

1. 冲洗：将已电泳完的胶放于托盘中用蒸馏水冲洗，

然后放置在脱色摇床上摇荡12 min。

2. 银染：加入200 ml 0.1% AgNO₃溶液摇荡8-12 min。

3. 洗涤：蒸馏水洗涤2次。

4. 显色：加入显色液，摇荡胶直到出现带纹为止。

显色液配方：

NaOH 4 g

甲 醛 2 ml

ddH₂O 200 ml

附：1）8%聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）配制 （总体积40 ml）

试剂 体积（ml）

40%丙烯酰胺 8

5TBE 8

10%过硫酸铵（AP） 0.30

N，N，N'，N'-四甲基乙二胺（TEMED） 0.03

ddH₂O 24

2）40% 39：1聚烯酰胺母液的配制（总体积100 ml）

丙烯酰胺 39 g

N，N'-亚甲双丙烯酰胺 1 g

加ddH₂O并稍加热使化学药品溶解，然后定容至100 ml。

3）40% 19:1聚丙烯酰胺母液的配制（总体积100 ml）

丙烯酰胺 38 g

N，N'-亚甲双丙烯酰胺 2 g

加ddH₂O并稍加热使化学药品溶解，然后定容至100ml。

4）5TBE（1L）

Tris碱 54.0 g

硼 酸 27.5 g

5 mol/L EDTA (PH=8.0) 20.0 ml

2.技术路线和实验方案:

技术路线：

实验方案：

1、 利用根据小麦第2部分同源群设计的PCR引物在辉县红、荆州黑麦和辉县红-荆州黑麦双倍体荆辉1号中进行扩增，筛选荆州黑麦特异标记；

2、 利用一套辉县红-荆州黑麦异染色体系进行扩增分析，筛选2R染色体特异标记；

3、 利用2R染色体特异标记分析2R染色体系列结构变异体，进行区段定位。

3.可行性分析:

通过RFLP分析，将1361764个小麦EST定位于小麦不同染色体上，其中第2部分同源群定位了EST，并已成功进行PCR标记的开发和应用，本研究通过第2部分同源群EST设计引物，可以筛选出荆州黑麦2R染色体特异标记，为构建荆州黑麦2R染色体物理图谱提供基础。

特色或创新之处

筛选一批新的荆州黑麦2R染色体特异标记，为荆州黑麦染色体物理图谱的构建提供基础，并且还有利于新的荆州黑麦染色体结构变异体的筛选。

4. 研究创新点

筛选一批新的荆州黑麦2R染色体特异标记，为荆州黑麦染色体物理图谱的构建提供基础，并且还有利于新的荆州黑麦染色体结构变异体的筛选。

5. 研究计划与进展

研究计划：

利用根据普通小麦第2部分同源群est设计的288对引物对普通小麦辉县红、荆州黑麦和辉县红-荆州黑麦双倍体荆辉1号进行扩增，筛选荆州黑麦染色体特异标记。后利用一套辉县红-荆州黑麦异染色体系，对筛选出的专化标记进行染色体定位。利用2r染色体特异标记分析2r染色体系列结构变异体，进行区段定位。

预期进展：